Frederick Sanger e la struttura dell'insulina (II)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

La prima parte di questo mio racconto delle vicende legate alla determinazione della struttura dell'insulina si era conclusa nel 1945, anno in cui avevamo lasciato Sanger con in mano appena i 'bandoli' della matassa proteica. La metafora non è molto azzardata perché allora lo scienziato inglese conosceva solo la posizione N-terminale di un residuo di glicina e di uno di fenilalanina. Questo risultato era stato faticosamente ottenuto attraverso lunghe ricerche che erano approdate all'uso del fluorodinitrobenzene (FDNB) per 'appiccicare' un dinitrofenile (DNP) al gruppo amminico libero, ma Sanger non era in grado di determinare il peso molecolare della proteina, così che sulla base dei dati pubblicati credeva di avere a che fare con (almeno) un dimero costituito da due coppie fra loro identiche delle catene di cui aveva determinato gli N-terminali. In ogni caso la successiva tappa che sembrava obbigata era il distacco delle catene, palesemente legate da ponti -S-S-. A questo scopo si dimostrò affidabile l'uso dell'acido performico, che interrompeva il ponte dando dei gruppi solfonici sulle catene separate, però - come sempre - si presentava difficile il passo seguente, della separazione macroscopica delle sostanze corrispondenti alle due catene. 

 

Fu allora che si offrì a Sanger la possibilità di un soggiorno di studio a Uppsala, dove il nostro chimico si recò principalmente per imparare la tecnica di cromatografia su colonne di carbone messa a punto nel famoso laboratorio diretto da Tiselius, e verificarne l'utilità per la separazione delle 'sue' catene. Il resoconto dell'incontro con lo scienziato svedese fatto dallo stesso Sanger è insolitamente aspro. Non solo ricorda che la tecnica gli diede il risultato errato della presenza di quattro catene, ma sottolinea che Tiselius volle includere in una nota a due nomi anche i dati sulla rottura dei ponti disolfuri, che egli aveva ottenuto per i fatti suoi in Inghilterra. "Fui piuttosto scioccato - scrive Sanger - perché in effetti non aveva contribuito in nessun modo e non lo avevo mai visto lavorare in laboratorio". E aggiunge: "Il lavoro che ne risultò è fortunatamente uno fra i miei meno conociuti, ed è l'unico di cui mi sono vergognato". Tuttavia, nonostante la 'buona volontà' di Tiselius, che ebbe il premio Nobel l'anno successivo, il soggiorno di Sanger a Uppsala non fu del tutto infruttuoso perché vi conobbe R.Synge, da cui fu introdotto ai segreti della ionoforesi su amido.

 

Tornato in Inghilterra Sanger si ritrovò al punto di partenza e si risolse a separare le due catene con i metodi collaudati della precipitazione frazionata. La frazione A, corrispondente al 'terminale' glicina risultò contenere circa 20 amminoacidi, mentre la frazione B, corrispondente all'altro 'terminale' fenilalaninico, ne conteneva circa 30. Contrariamente alle aspettative la catena B risultò di più facile soluzione, mediante l'uso abile della idrolisi acida e dell'FDNB. In effetti Sanger e i suoi inventarono e risolsero un geniale puzzle, basato sull'isolamento, l'analisi e la 'connessione' dei tanti frammenti ottenuti: venivano eseguiti dei frazionamenti preliminari (ionoforesi, cromatografia per scambio ionico, adsorbimento su carbone), poi le frazioni contenenti da 5 a 20 peptidi venivano sottoposte a cromatografia su carta bidimensionale. Le 'macchie' venivano ritagliate, il materiale eluito, sottoposto a idrolisi completa e analizzato negli aminoacidi costituenti.

 

Vorrei fare un esempio semplice delle mosse tipiche di questo 'gioco'. In una certa frazione particolarmente acida erano presenti solo sei peptidi diversi, ciascuno dei quali conteneva acido cisteico; poiché a sua volta la catena B aveva solo due residui cisteici tutte le sequenze si dovevano ridurre a due soltanto. Due peptidi davano indicazioni immediate: Val.CySO3H e Leu.CySO3H indicavano che i due residui cisteici erano 'preceduti' rispettivamente da un residuo di valina e da un residuo di leucina, mentre dall''altra parte' era sempre presente glicina, come si deduceva dall'esistenza dell'unico peptide CySO3H.Gly. Questi dati erano già sufficienti a determinare la sequenza del peptide Leu.(CySO3H, Gly): infatti la posizione terminale della leucina era stata individuata con il solito metodo del DNP, e l'ordine indeterminato nella notazione fra parentesi era fissato appunto come CySO3H.Gly. Ragionamenti del tutto analoghi, che il lettore può fare da sé, portavano a concludere che il peptide Val.(CySO3H,Gly) doveva avere la sequenza Val.CySO3H.Gly e che  Leu.(CySO3H, Gly, Val) doveva possedere la sequenza Leu.Val.CySO3H.Gly.

 

Il paziente lavoro di 'ricostruzione' della catena B fu compiuto quasi completamente nel solo anno (1949) che il chimico austriaco Hans Tuppy trascorse a Cambridge. Sanger, che certo non è stato uno scansafatiche, ha scritto che Tuppy era "uno dei più duri lavoratori" che avesse mai conosciuto. Nel dipartimento il laboratorio era separato dalla camera delle cromatografie da un lumgo corridoio, e in quell'anno "divenne abituale vedere Tuppy camminare a tutta velocità lungo il corridoio con i cromatogrammi in mano. Non correva mai, ma per stargli dietro chiunque doveva correre". Va comunque notato che la tecnica della lisi acida non bastò a determinare la sequenza della catena B, sia per questioni tecniche legate alla cromatografia su carta (cromatogrammi non risolti per l'eccessiva velocità delle misture), sia per l'estrema labilità di certi legami peptidici. Così Sanger e i suoi collaboratori si decisero ad usare gli emzimi proteolitici, di cui però si sospettava una possibile azione di ri- arrangiamento sulle sequenze naturali. In effetti tutto andò bene e nel 1951 Sanger e Tuppy poterono pubblicare la sequenza completa della catena B.

          

La sequenza della catena A presentava - manco a dirlo - altri problemi e fu ricostruita con un uso abile della ionoforesi su carta (1953). Poichè nello stesso periodo Harfenist e Craig pubblicarono un lavoro in cui si dimostrava che il peso molecolare dell'insulina era di circa 6000 (peso che corrispondeva alle due catene A e B)  per una soluzione completa del problema mancava 'solo' l'individuazione delle connessioni fra i residui della cisteina. Ben presto però Sanger si accorse  che durante le reazioni di idrolisi si aveva un riarrangiamento casuale, per cui ogni residuo di cisteina sembrava connesso con tutti gli altri. Così nel laboratorio di Cambridge si iniziò  un'indagine ad ampio raggio sulla reattività dei ponti disolfuro fra residui di cisteina, in funzione del pH e dell'attività autocatalitica dei gruppi -SH. La struttura completa venne pubblicata nel 1955, e due anni dopo la tenacia di Sanger fu coronata con il premio Nobel per la chimica. Dal punto di vista conoscitivo veniva definitivamente convalidata la teoria di Emil Fischer sulla struttura delle proteine, e lo stesso problema delle strutture proteiche veniva ridefinito, perché, finalmente, si aveva la certezza che la 'matassa', per quanto ingarbugliata, aveva pochi filamenti, che questi erano dotati a loro volta di una precisa individualità chimica, e che - ahime! - tutte le teorie che avevano proposto andamenti periodici nelle sequenze erano errate. Ogni proteina, in un certo senso, era un caso a sé, e davanti ai biochimici si apriva un campo di ricerca veramente sterminato.

 

Usate il motore di ricerca!

 

Torna alla home page

 

< precedente |