Frederick Sanger e la struttura dell'insulina (I)

 

 

 

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Fra gli scienziati  l'ironia è una dote rara, rarissima nella versione dell'autoironia. Lungo i quaranta anni  dedicati alla biochimica Frederick Sanger ne ha fatto abbondante uso (per se stesso) e dono (ai suoi collaboratori), giungendo ad un risultato accademico ineguagliato: due premi Nobel per la chimica, nel 1958 e nel 1980.

 

L'incontro di Sanger con le proteine avvenne durante le ricerche per il PhD, condotte fra il 1940 e il 1943 nel Dipartimento di Biochimica di Cambridge. Secondo quanto ha scritto lo stesso Sanger, molto probabilmente non avrebbe mai potuto studiare in quella prestigiosa università se i suoi genitori "non fossero stati discretamente ricchi", perché il giovane  non era "accademicamente brillante". In realtà gli mancava semplicemente ciò che noi chiamiamo 'parlantina', dato che i suoi insegnanti al termine di un anno supplementare di studi in biochimica gli diedero un first grade degree. Subito dopo (1940) Sanger fece due mosse fondamentali: si sposò - a ventidue anni - e fu accettato come allievo per il dottorato, aiutato in questo dalla duplice fortunata circostanza di essere esentato dagli obblighi militari in quanto obbiettore di coscienza, e di non aver bisogno di un aiuto finanziario in quanto benestante. Il lavoro per la tesi di dottorato, sul metabolismo della lisina, lo familiarizzò con la chimica degli amminoacidi, così che al momento dell'arrivo del nuovo direttore del Dipartimento Sanger potè inserisi nel filone di ricerca principale. Infatti A.C. Chibnall, il nuovo direttore e successore del grande Hopkins (premio Nobel per la scoperta delle vitamine), aveva portato con sé dall'Imperial College numerosi collaboratori ed una solida ricerca sull'insulina.

 

L'insulina era un buon 'oggetto biochimico', sia per la sua importanza fisiologica, sia perchè era una delle poche proteine che allora potevano essere ottenute allo stato puro, ma un'iniziale intenzione di Sanger di cercare di individuare la sequenza di amminoacidi avrebbe avuto il sapore di una scommessa piuttosto azzardata. Pur prendendo per buona la sua testimonianza che nel Dipartimento tutti accettavano la teoria di Fischer che le proteine erano costituite da lunghe catene di amminoacidi, non solo questa teoria non aveva allora nessun solido fondamento sperimentale, ma fino al 1948 si credette che l'insulina avesse un peso molecolare di 36.000-48.000. Nel 1943 ciò avrebbe significato porsi il compito di ricostruire il collegamento (forse lineare) di 300-400 amminoacidi, mentre ancora nulla si sapeva di questo ordine per nessuna proteina.

 

In realtà l'unica posizione nota di un amminoacido in una proteina riguardava proprio l'insulina, perchè nel 1935 era stata determinata la posizione N-terminale di un residuo di fenilalanina. Le ricerche di Chibnall avevano inoltre stabilito che nell'insulina non erano presenti residui di triptofano e di metionina, e che un alto contenuto di Ó-ammino gruppi lasciava supporre l'esistenza di (parecchie) brevi catene. In un  interessantissimo articolo autobiografico (del 1988) Sanger ha affermato: "Non si pose il problema di una mia intenzione di determinare la sequenza completa dell'insulina, nè allora (1943) né per parecchio tempo dopo". Quel che è certo è che la ricerca iniziò, su indicazione di Chibnall, a partire dalla 'semplice' determinazione dei residui terminali, e che fin da questo inizio si sviluppò su un fronte inaspettatamente ampio. Da una parte Sanger e i suoi collaboratori dovettero cercare i reattivi più adatti per frammentare (e 'marcare') nei modi più opportuni la molecola dell'insulina, e dall'altra si impegnarono a risolvere i sempre nuovi problemi posti dalla separazione dei 'frammenti' così ottenuti. Ed è qui che la storia di Sanger si raccorda con quelle già raccontate nelle sezioni precedenti, a proposito delle tecniche di separazione escogitate da Archie Martin; senza  queste tecniche, così semplici e selettive, l'indagine sulle sequenze dell'insulina non avrebbe potuto prender corpo - anche per la carenza di mezzi che assillò la scienza inglese negli anni di guerra e in quelli successivi. Poiché dal punto di vista conoscitivo le vicende che portarono alla struttura dell'insulina sono veramente affascinanti, in questa nota parlerò solo del primo passo, rinviando al nostro prossimo appuntamento tutto il resto dell'avvincente percorso tracciato dall'ingegno chimico di Sanger.

 

Nel 1945, quando Sanger propose l'uso del 2,4- dinitrofenilfluoruro, erano stati discussi almeno dieci reattivi per determinare chimicamente l'ammino acido N-terminale di una proteina, ed una mezza dozzina di metodi per il terminale carbossilico. In effetti era più 'facile' orientarsi verso il residuo con l'-ammina libera perchè dopo la demolizione della proteina i composti carbossilici ottenuti erano più facilmente cristallizzabili, e così aveva fatto il nostro (futuro) premio Nobel. Egli aveva iniziato la ricerca del metodo più adatto avendo già in vista l'applicazione  della cromatografia di partizione allora appena scoperta, e dopo diversi tentativi infruttuosi aveva concentrato l'attenzione su un reattivo introdotto da Emil Abderhalden nel 1923, il 2,4 dinitro- clorobenzene. A favore dell'uso di questa sostanza vi era il fatto che i derivati dinitrofenilici (DNP) ottenuti dopo l'idrolisi acida della proteina erano di un bel colore giallo brillante, e quindi le bande corrispondenti erano facilmente seguibili lungo la colonna cromatografica; a sfavore si poneva l'alta temperatura a cui il reattivo agiva sulla proteina, così che durante la reazione di 'marcatura' si aveva già una certa idrolisi dei legami peptidici. Sanger cercò una sostanza più attiva nell'1,2,4 trinitrobenzene, di cui sintetizzò una piccola quantità, ma un altro possibile rincalzo, il fluoroderivato (FDNB) fu trovato da Chibnall letteralmente 'dietro l'angolo', e cioè presso B.C.Saunders, un altro ricercatore di Cambridge.

 

La messa a punto del metodo non fu semplice; ad esempio, mentre veniva saggiata la reattività dell'FDNB con tutti gli amminoacidi presenti nell'insulina, si scoprì che la DNP-glicina, estratta con etere dagli idrolizzati, dava due bande perché entrambi gli atomi di idrogeno del gruppo amminico potevano essere sostituiti dal gruppo DNP. Attraverso "considerevoli difficoltà" questo secondo prodotto di reazione fu quasi del tutto eliminato ( cambiando tampone!), e questo fu un bene dato che la glicina e la già nota fenilalanina costituivano gli unici acidi N-terminali presenti nell'insulina. La determinazione quantitativa dei DNP-derivati portava alla conclusione che erano presenti due differenti  catene per ogni 6000 unità di peso molecolare. Oltre alle conoscenze tecniche acquisite, e alla scoperta di un ottimo reattivo che sarebbe presto entrato nell'uso generale, questo era tutto ciò che due anni di lavoro avevano prodotto di nuovo sulla struttura dell'insulina.

 

 

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