Nascita di una tecnica povera: la cromatografia su carta

 

 

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Usate il motore di ricerca!

Ho già accennato allo sviluppo della cromatografia su carta nel laboratorio di Leeds dove lavoravano Martin e Synge, ma questa tecnica 'povera' ha dato risultati così notevoli da meritare qualche ulteriore annotazione storica.

 

In un convegno tenuto a New York nel 1979 A.H.Gordon ha raccontato qualche dettaglio della scoperta, ricordando innanzi tutto come la cromatografia di ripartizione su colonna non desse risultati abbastanza sensibili nel caso degli amminoacidi acetilati. Gordon era stato incaricato di rintracciare qualche reazione che agendo su porzioni di eluito potesse segnalare la presenza di quantità molto piccole di amminoacidi, e la ninidrina si era rivelata molto sensibile. In un primo momento Gordon faceva cadere una goccia di eluito su carta da filtro, faceva essiccare, impregnava con soluzione di ninidrina  e faceva essiccare a 100°. Le prove preliminari avevano dimostrato che in questo modo si otteneva una colorazione porpora con quantità di ammino acidi liberi o di peptidi dell'ordine del microgrammo, ma in realtà questo metodo non fu mai applicato agli eluiti ottenuti dalla cromatografia su colonna, perchè - sono parole di Gordon: "Martin fece l'essenziale salto (jump) intellettuale e suggerì che la carta da filtro di per sé poteva essere una matrice cromatografica adatta".

             

I primi cromatogrammi su carta del gruppo di Leeds furono circolari. La carta imbevuta d'acqua era posta sul fondo di un disco di Petri, mentre una 'coda'al centro del disco faceva giungere, per capillarità,   butanolo saturo d'acqua a cui era stata aggiunta una goccia della soluzione di amminoacidi da analizzare. Quando il butanolo raggiungeva il bordo del disco la carta era essiccata e poi spruzzata con soluzione di ninidrina in butanolo anidro. Ben presto vennero utilizzati recipienti chiusi, saturi di vapor acqueo, in cui la fase mobile 'scendeva' lungo strisce di carta a partire  da vaschette poste nella parte alta degli 'scatoloni'. Il procedimento era piuttosto lento, ma si potevano mettere in opera molte strisce contemporaneamente; per di più, quasi subito si ebbe l'importante sviluppo della cromatografia bidimensionale. Con questa tecnica una goccia di soluzione posta su un vertice del foglio di carta bibula veniva separata in varie frazioni da un primo solvente; queste frazioni, collocate lungo un bordo, venivano ulteriormente frazionate girando il foglio di 90° ed utilizzando un secondo solvente. Erano procedimenti elementari, che davano però risultati eccellenti. I ricercatori di Leeds passarono da una sorpresa all'altra quando si accorsero che il metodo funzionava perfettamente con le più diverse classi di composti. Martin ha descritto con amichevole ironia l'atteggiamento dei numerosi visitatori del suo laboratorio: "venivano e guardavano i cromatogrammi su carta e poi andavano via e usavano la cromatografia su carta per le loro separazioni". A rileggere questa frase sembrerebbe che il cordialissimo Martin si aspettasse un qualche (blando) ringraziamento.

             

Mentre sappiamo che Martin otterrà grandissime soddisfazioni negli anni successivi, possiamo  comunque capire quanto potesse essere 'provvidenziale' la cromatografia su carta attraverso le vicende di un giovane americano, studente di medicina, che nell'estate del 1952 voleva 'assaggiare' le sue capacità di ricerca. Qui il racconto è affidato ai ricordi di Arthur Karmen.

 

Karmen aveva allora 22 anni, e stava cercando di impiegare la lunga estate di vacanza in una qualche attività di ricerca. In effetti le opportunità erano molto poche, e l'unica che si realizzò gli fu offerta da un medico, F. Wroblewski, che suggeriva la possibilità che la valutazione di certi enzimi nel siero sanguigno potesse essere utilizzata a livello diagnostico. Fra l'altro Wroblewski pensava che una  concentrazione anomala di transaminasi glutamico-ossalacetica (TGO), particolarmente presente nel muscolo cardiaco, potesse diventare un indice di infarto miocardico. I biochimici accademici erano piuttosto scettici, e scoraggiarono il giovane Karmen, che, tuttavia, accettò un 'fondo' di ricerca di 200 dollari e iniziò  a lavorare sul problema. Dalla letteratura appurò che esistevano tre metodi per determinare la TGO: i primi due richiedevano, rispettivamente misure UV o gasvolumetriche con il metodo di Warburg. In entrambi i casi la strumentazione necessaria non era accessibile a studenti inesperti come Karmen. Rimaneva la 'terza via', ovvero la determinazione degli amminoacidi con cromatografia su carta, dopo incubazione dei substrati, una via obbligata, dati i 'mezzi' a disposizione del giovane studente di medicina. Parecchi anni dopo Karmen così descrisse la sua iniziazione: "Un assistente mi prestò un contenitore cilindrico di vetro con cui giocare, e la sua copia di una review di A.J.P. Martin; egli mi impartì anche un corso di cinque minuti sulla cromatografia su carta in fase discendente - così come l'aveva compresa".

 

Karmen comprò i reagenti e si mise a trafficare con un certo scetticismo, ma i primi risultati, mediocri, sembrarono ai suoi occhi inesperti del tutto soddisfacenti. Incoraggiato, non solo migliorò man mano la precisione dei suoi saggi, ma acquistò una vasca per pesci da 120 litri e, con l'aiuto del padre, lo attrezzò per fare fino a 16 analisi enzimatiche contemporaneamente. La grande occasione giunse la primavera successiva, quando potè esporre i suoi risultati duramte una 'giornata della ricerca' riservata agli studenti. Fra i suoi ascoltatori c'era Severo Ochoa, che di là a sei anni avrebbe preso il premio Nobel per le sue ricerche sull'RNA. Ochoa aprì le porte del suo laboratorio a Karmen, che con la sospirata strumentazione UV confermò i risultati ottenuti con la cromatografia 'da acquario' e aprì la strada all'uso diagnostico della determinazione clinica della TGO.

 

 

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