5) Ipotesi ed interpretazioni elaborate nello studio sulle possibili forme di riproduzione dei micoplasmi

Le modalità di riproduzione dei micoplasmi furono studiate da Sinha e Paliwal (1969) attraverso indagini compiute su piante di trifoglio affette da virescenza. Gli autori sostengono che i corpi elementari (forme piccole e tonde) avrebbero origine per gemmazione da cellule mature e da forme grandi di aspetto filamentoso o irregolare. Queste ultime libererebbero i corpi elementari o corpi coccoidi per rottura della membrana della cellula madre. I corpi elementari con il passare del tempo diverrebbero via via più grandi assumendo un aspetto simile alle cellule mature o alle forme filamentose da cui sono state generate. Accanto a queste due modalità Sinha e Paliwal (1969) descrivono la riproduzione per scissione binaria che si attua con la divisione della cellula madre in due cellule figlie simili ad essa.

Belli (1970) nell’articolo "I micoplasmi agenti fitopatogeni di recente scoperta" parla di "corpi elementari" per descrivere le cellule che si differenziano da quelle di aspetto filamentoso e di forme piccole se si sono originate per gemmazione dalle cellule mature.

Inoltre Belli (1970) specifica che i corpi elementari si differenziano in cellule di aspetto filamentoso, ma non fa alcun riferimento al fatto da essi possano assumere le caratteristiche delle cellule mature. Tali asserzioni sono ripetute due volte nell’articolo menzionato (19).

(19) Belli (1970) descrive la riproduzione dei micoplasmi secondo le interpretazioni di Freundt (1969); queste, da una nostra attenta lettura, paiono discostarsi in parte dai modelli proposti da Sinha e Paliwal (1969).

Lovisolo (1973) afferma che secondo alcuni autori i corpi elementari si originerebbero per gemmazione sia dalle forme intermedie che dalle cellule mature, essi darebbero poi origine a forme filamentose, le quali produrrebbero a loro volta altri corpi elementari. La posizione riportata dall’autore è differente dalle precedenti in quanto si parla di corpi elementari prodotti anche dalle forme intermedie.

Le controversie sui cicli e sulle possibili forme di riproduzione (forse anche più di tre) nascono secondo Lovisolo (1973) dalle piccole dimensioni dei micoplasmi, che non consentono di poter seguire la riproduzione delle singole cellule.

Interrogativi permangono anche sulla scissione binaria. Lovisolo (1973) afferma che tale forma di riproduzione è certa per M. gallisepticum e M. orale, dubbia per le altre specie, ma probabile. Lovisolo (1973) esprime la convinzione che l’incremento logaritmico delle cellule in substrati liquidi confermerebbe la scissione binaria, anche se non ne costituisce una prova.

Lovisolo (1973) sottolinea inoltre che relativamente a filamenti, corpi elementari e gemmazione non è ancora stato definitivamente accertato se siano stadi del ciclo riproduttivo dei micoplasmi, oppure prodotti o fasi degenerative. Worley (1970) ritiene esista una relazione tra le forme filamentose osservate in alcune piante colpite da giallumi e le catene di micoplasmi riscontrate nei tubi cribrosi. A tal riguardo si può affermare che le forme filamentose sono ritenute molto importanti per la riproduzione di alcune specie (Bredt, 1969; Davis e Whitcomb, 1971; Razin e Cosenza, 1966; Razin et al., 1967). Freundt (1969), Razin (1969), Razin et al. (1967) riscontrarono la presenza di numerose forme filamentose nelle giovani colture e le considerarono correlate all’optimum di crescita dei microrganismi. Furness (1970) Furness et al. (1968) rilevarono in M. pneumonie. M. orale, M. arthritidis, M. fermentans, M. hominis e M. salivarum forme filamentose soltanto nella "death phase" e non durante la scissione binaria dove si registra la massima crescita delle colonie. Anderson e Barile (1965) suggerirono che una singola specie può riprodursi secondo modalità diverse. Nelle colture di M. gallisepticum, (unica specie identificabile dall’analisi della sua morfologia), dove è stata accertata la riproduzione per scissione binaria furono identificate forme filamentose (Razin e Cosenza, 1966).

Anderson e collaboratori (Razin, 1969) si posero interrogativi riguardo le dimensioni vitali minime dei micoplasmi in grado di riprodursi e di formare nuove colonie. Secondo gli autori esse erano di circa 250 nm di diametro. Hayflick e Chanock (1965) stimarono le dimensioni vitali minime vitali tra 125 e 250 nm. Lovisolo (1973) afferma che altri autori con tecniche differenti hanno calcolato dimensioni vitali minime maggiori, cioè da 200 a 300 nm. Questi valori non sono molto lontani da quelli calcolati teoricamente da Morowitz e collaboratori (Razin, 1969). Gli autori appena menzionati hanno calcolato il volume minimo capace di ospitare il più piccolo genoma di micoplasma a loro noto,un ribosoma ed una membrana citoplasmatica, corrispondente ad una sfera del diametro di circa 130 nm. La determinazione delle dimensioni dei micoplasmi risulta alquanto difficoltosa come sottolineano van Boven C. P. A. et al. (1968), in quanto l’elasticità conferita dall’assenza di parete, consente ad essi di passare attraverso i pori dei filtri anche quando il loro diametro è inferiore a quello dei microrganismi. Freundt (1969) e Maniloff (1970) affermano che il ruolo delle forme filamentose nella riproduzione dei micoplasmi, la formazione di corpi elementari all’interno di esse e la definizione delle dimensioni vitali minime compatibili con la vita dei micoplasmi sono argomenti ampiamente dibattuti dai ricercatori ed oggetto di controversie. Biberfeld G. e Biberfeld P (1970), Kammer et al.,(1970), Klainer e Betsch (1970) sostennero che era necessario considerare approcci diversi come ad esempio l’osservazione dei micoplasmi al microscopio elettronico a scansione per chiarire i dubbi sulla riproduzione di questi microrganismi. Steere (1970), Tillack et al. (1970) suggerirono l’impiego della tecnica "freeze – etching" per superare gli interrogativi ancora aperti.

 

6) Patogenicità ed epidemiologia: aspetti complessi, ma cruciali per lo studio dei micoplasmi

La ricerca dei vettori delle micoplasmosi è alquanto laboriosa e più difficile rispetto all’individuazione delle specie botaniche potenzialmente ospiti dei micoplasmi. Whitcomb, (1981) avvalora questo pensiero nelle seguenti espressioni:

"As is often the case with multiply vectored pathogens, discovery of new vectors has tended to lag behind the discovery of new plant hosts. The reason for this are technological; vector searches are intrinsically more laborious than experimental host range studies accomplished by feeding a known vector on a taxonomically wide array of test plants."

Risulta comunque problematica anche la determinazione delle specie ospiti dei micoplasmi. Molte cicaline sono attratte maggiormente dalle piante colpite da giallumi, così che un insetto vettore di un patogeno può essere infettato da altri micoplasmi. Successivamente tale complesso di patogeni è trasmesso dagli insetti a piante sane che risultano così colpite da più malattie. Non per nulla il ricercatore Whitcomb (1981) riporta la seguente espressione:

"Many leafhoppers are selectively attracted to yellowed plants, so the chance that a leafhopper infected with one disease agent might be attracted to a plant infected with another plant disease agent and might subsequently transmit both agents to healthy plants is probably not nearly as low as one might at first assume."

Nonostante i problemi appena asseriti Kunkel nel 1926 comunicò (prima ancora che i micoplasmi fossero ritenuti agenti fitopatogeni) che l’agente "dell’Aster Yellow" infetta per innesto numerose piante con una grande gamma di sintomi caratteristici (giallumi, fillodia, sterilità e rachitismi) ed ha come vettore la cicalina Macrosteles fascifrons che dopo un lungo periodo d’incubazione (6 – 15 giorni) rimane infetta per tutta la durata della vita. Black nel 1940 e Maramorosch nel 1952 stabilirono attraverso serie di passaggi successivi, con lo scopo di diluire l’inoculo iniziale oltre ogni ragionevole diluizione sopportata, che l’agente "dell’Aster Yellow" si moltiplica nel corpo dell’insetto vettore. Carter (1966) individuò più di 30 cicaline come vettori del giallume dell’astro (particolarmente attive risultano quelle appartenenti al genere Macrosteles quali: M. fascifrons Stal, M. quadripuntulatus Kirsch. e M. sexnotatus Fall.). Allo stesso modo Boyce et al. (1951) scoprirono che Oliarius atkinsoni è il vettore del giallume del Phormium, quando ancora non si riteneva che i micoplasmi potessero avere un’azione fitopatogena.

A poca distanza dalla scoperta dei micoplasmi come agenti eziologici di malattie delle piante Maramorosch et al. (1968), Giannotti et al. (1968), Maillet et al. (1968), Nielson (1968) individuarono alcune cicaline floemomize come i principali vettori di queste fitopatie. Belli et al., (1973) constatarono di avere osservato ripetutamente forme riferibili a micoplasmi simili a quelle riscontrate nel floema delle piante infette in vari organi di cicaline vettrici: ghiandole salivari, micetoma e intestino medio.

Belli et al. (1973) convinti del ruolo prioritario di alcuni insetti nella trasmissione dei micoplasmi affermarono che

"il giallume dell’astro è molto frequente anche in Italia, soprattutto nelle zone dove le colture floricole si succedono per più anni in concomitanza con le specie di cicaline più attivamente vettrici."

Gli insetti vettori di numerose fitopatie di presunta origine micoplasmica sono comunque ad oggi sconosciuti (Belli et al., 1973), come è dubbia la trasmissione di micoplasmi da parte di certe specie di insetti. Hampton et al. (1969) affermarono di essere riusciti a trasmettere micoplasmi isolati da pisello sia per succo sia mediante l’afide Acyrthosiphon pisum. Belli (1970) evidenziò che tali dati non erano stati riscontrati da altri ricercatori e che in ogni caso le modalità di trasmissione supposte (con succo e afidi) non sono tipiche dei micoplasmi.

Dale e Kim (1969), Giannotti et al. (1969) hanno ipotizzato che alcune specie di Cuscuta facendo da ponte tra piante diverse, sono in grado di trasmettere i micoplasmi. Belli (1970) pur sostenendo la tesi dei ricercatori menzionati, sottolinea l’importanza secondaria della Cuscuta come vettore rispetto alle cicaline.

Belli (1970) evidenziò la facile diffusione dei micoplasmi con la moltiplicazione agamica (per talea, bulbi, rizomi, marza) e attraverso l’innesto.

I micoplasmi non risultano invece trasmissibili per seme (Belli et al., 1973) e per via meccanica (es. sfregamento di foglie con estratti provenienti da piante infette, impiego di cesoie utilizzate precedentemente su piante infette).

 

7) Peculiarità e problemi incontrati nello studio dei micoplasmi ed organismi affini in relazione alla loro diffusione nei tessuti vegetali ed agli organi di attacco

I micoplasmi delle piante, a differenza di quelli degli animali vertebrati, sono stati osservati all’interno di cellule vitali nelle quali si moltiplicano (Davis e Whitcomb, 1971). Nei vertebrati invece i micoplasmi si moltiplicano all’esterno delle cellule. Questa scoperta ha aperto nuovi orizzonti alla ricerca in quanto può giustificare le difficoltà incontrate dagli studiosi nella coltivazione in vitro dei micoplasmi patogeni delle piante. Davis e Whitcomb (1971) li definirono pertanto parassiti obbligati intracellulari. Davis e Whitcomb, (1971) sottolinearono che tale scoperta metteva in luce notevoli differenze tra i micoplasmi parassiti degli animali e dei vegetali.

Le infezioni da micoplasmi, come quelle da virus, sono di tipo sistemico e tale caratteristica ha indotto i ricercatori a confonderli con questi ultimi come sottolineano Belli et al. (1973).

Gourret, (1972) afferma che i micoplasmi si trovano generalmente nel floema: nella linfa elaborata dei tubi cribrosi, nel ialoplasma delle cellule compagne, delle cellule preconduttrici e di quelle del parenchima floematico. Belli (1970), Belli et al. (1973) affermano invece che le forme fitopatogene sono state osservate sinora soltanto nel tessuto floematico e in particolare nei tubi cribrosi, nei quali i micoplasmi si moltiplicano e si accumulano spesso in quantità notevoli. In un articolo di Belli (1970) si sottolinea il comportamento un po’ fuori dalla norma osservato da Pellegrini et al. (1969), Baldacci et al. (1970) nelle piante di riso affette da giallume. Secondo gli autori in queste piante i micoplasmi hanno raggiunto concentrazioni più elevate nelle cellule adiacenti ai tubi cribrosi che nei vasi stessi.

I micoplasmi secondo quanto riportato da Sinha e Paliwal (1969) si propagano da una cellula all’altra dei tubi floematici passando attraverso i pori esistenti nelle placche cribrose. E’ probabile secondo Belli et al. (1973) che in modo analogo passino attraverso i plasmodesmi alle cellule parenchimatiche del libro.

In tabacco affetto da "Stolbur" Cousin et al. (1971) hanno constatato che i micoplasmi non sono presenti nelle cellule meristematiche prima della differenziazione dei tessuti liberiani. Sono invece presenti circa 0,2 mm sotto l’apice, in cellule ricche di ribosomi e contenenti ancora cloroplasti, mitocondri ed ergastoplasma, considerate futuri tubi cribrosi per l’aspetto madreperlaceo della parete e l’inizio della comparsa del vacuolo centrale.

Caudwell (1970), comunicò personalmente al ricercatore Belli che i micoplasmi presenti nelle piante di vite affette da flavescenza dorata non presentavano una distribuzione omogenea, ma localizzata in alcune parti ed in determinate fasi del ciclo vegetativo. Alle stesse conclusioni giunsero Hibino e Schneider (1970) a seguito di osservazioni condotte su piante di pero colpite da "Pear Decline". Questa peculiarità rende più difficile la ricerca e lo studio degli agenti eziologici responsabili delle fitopatie di presunta origine micoplasmica.

 

8) Individuazione del range di ospiti

E’ un sistema che potrebbe essere di ausilio per la classificazione dei micoplasmi. Ogni specie infatti come sostengono McCoy et al. (1989) attacca un range di piante ospiti più o meno ampio e definito. L’impiego di questo metodo presenta comunque dei problemi in quanto alcuni micoplasmi hanno un range di ospiti che si sovrappone parzialmente con quello di altri agenti patogeni (McCoy et al. 1989). L’agente dell’"aster yellows MLO" ha un range di ospiti che si sovrappone in parte con quello del micoplasma responsabile della malattia nota come "Canadian clover phyllody" (McCoy et al. 1989). In alcuni casi inoltre non c’è una corrispondenza tra il range di piante ospiti sperimentale e quello osservato in natura. McCoy et al. (1989) sottolineano che il naturale range di piante ospiti è strettamente legato all’ecologia degli insetti vettori.

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