4) Aspettative e limiti correlati alle tecniche di laboratorio impiegate per la determinazione dei micoplasmi e di microrganismi affini

La classificazione dei micoplasmi è da sempre risultata alquanto complessa. Edward D. G. et al. (1967), riportano i criteri minimi fissati dal Subcommittee on Taxonomy of the Mycoplasmatales per stabilire o nominare una nuova specie di micoplasmi. Una specie può essere identificata in base ai seguenti criteri:

la descrizione delle caratteristiche sierologiche e biologiche;

la deposizione di un rappresentativo prototipo della specie o razza in una collezione di colture tipo;

la pubblicazione del nuovo nome (nel caso dell’identificazione di una nuova specie) su una rivista di ampia circolazione tra i microbiologi.

Lovisolo (1973) evidenzia le difficoltà correlate all’identificazione dei micoplasmi; per essa non ci si può basare secondo il ricercatore sulle caratteristiche morfologiche in quanto non costanti e legate alle condizioni di sviluppo. Lovisolo (1973) descrive le modalità disponibili per identificare i micoplasmi: analisi di alcune caratteristiche fisiologiche, aspetto delle colture, patogenicità, tecniche di biologia molecolare (determinazione di elementi di sequenza nucleotidica e ibridazione di acidi nucleici), elettroforesi e soprattutto le reazioni sierologiche (12).

(12) La necessità di ricorrere a tutte queste tecniche è legata, a nostro avviso, alla impossibilità di applicare per i micoplasmi i postulati di Koch.

Osservazioni al microscopio elettronico.

Il microscopio elettronico è uno strumento che ha dato un notevole contributo allo studio dei micoplasmi che hanno dimensioni molto piccole ed inferiori a quelle dei batteri provvisti di parete come sottolineano Conti e Barba (1996) nella espressione qui riportata:

"Fino a poco tempo fa la diagnosi dei fitoplasmi era unicamente affidata alle osservazioni al microscopio elettronico di sezioni ultra – sottili di tessuti vegetali infetti o alla trasmissione, tramite ponte di cuscuta o vettori, di piante indicatrici erbacee."

Queste procedure sono purtroppo aspecifiche e non consentono di differenziare un fitoplasma dall’altro (Conti e Barba, 1996). Le sezioni ultra-sottili non permettono inoltre di evidenziare le forme filamentose e di distinguere i micoplasmi dagli spiroplasmi. Per ovviare a questi inconvenienti, McCoy et al. (1989) consigliano in aggiunta alle sezioni ultra-sottili, di allestire preparati di maggior spessore (350 – 1000 nm).

Belli et al. (1973) esaminando al microscopio elettronico preparati ottenuti a partire da piante di Chrysanthemum frutescens colpite dal giallume della margherita (malattia di probabile origine micoplasmica), osservarono numerosi corpi riferibili a micoplasmi localizzati nei cribi all’interno dei quali notarono anche numerose forme in fase di moltiplicazione. Belli et al. (1973) notarono nei cribri delle foglie e dei petali verdi di Gerbera hybrida colpita da virescenza numerose forme riferibili a micoplasmi talora unite fra loro a formare catenelle.

Le tecniche di preparazione dei campioni da osservare al microscopio elettronico possono indurre i ricercatori a commettere errori. Reuss (1967) osservò che durante il processo di essiccazione si formavano a partire dai corpi sferici dei micoplasmi strutture molto simili alle forme filamentose che furono definite "Protrusions" dall’autore (13)

(13) Reuss e Razin usano il termine “protrusions” per indicare gli artefatti. Davis e Whitcomb utilizzano invece indifferentemente i termini “protrusions” e “artifacts”.

Questi artefatti come fecero notare Razin et al. (1967) si distinguono dalle forme filamentose dei micoplasmi per il diametro che non risulta uniforme e per le dimensioni più contenute. Nei campioni preparati per l’osservazione al microscopio a contrasto di fase il rischio di formazione di artefatti si riduce notevolmente. Razin e Cosenza (1966) utilizzando il microscopio a contrasto di fase osservarono molte strutture filamentose nelle colonie mantenute su substrati di coltura liquidi.

Attraverso l’impiego del microscopio a contrasto di fase o meglio con il microscopio a campo oscuro si possono osservare gli spiroplasmi nella linfa di piante infette (McCoy et al., 1989). I micoplasmi per contro non si riescono a distinguere da particelle pleomorfiche sempre presenti nella linfa delle piante (McCoy et al., 1989). Recenti tecniche di colorazione (colorante Dienes) consentono di osservare i micoplasmi in situ con l’impiego del microscopio a campo scuro (Deely et al., 1979). Con la tecnica nota come "DNA – specific fluorochromes" basata sulla colorazione del DNA dei micoplasmi all’interno dei tubi cribrosi (anucleati quando sono maturi) e con l’impiego del microscopio a fluorescenza è possibile individuare questi patogeni (McCoy et al., 1989) (14).

(14) E’ interessante notare come la biologia delle piante aiuti in questo caso il lavoro del ricercatore. L’assenza del nucleo nelle cellule mature dei tubi cribrosi permette di utilizzare la tecnica menzionata senza confondere il DNA dei micoplasmi con quello delle cellule vegetali.

 La fluorescenza del DNA dei micoplasmi presenti nei tubi cribrosi può essere facilmente distinta dall’autofluorescenza dei tessuti dell’ospite (McCoy et al., 1989).

Elettroforesi.

Lovisolo (1973) parla di questa tecnica ed afferma: studi comparativi sulle frazioni proteiche di micoplasmi sono stati effettuati con l’elettroforesi in gel di poliacrilammide, che dà figure specifiche, riproducibili, non influenzate dalle condizioni di sviluppo. Lovisolo (1973) sottolinea inoltre che i risultati ottenuti con l’elettroforesi sono in accordo con quelli sierologici. Ad un’analoga conclusione erano giunti Davis e Whitcomb già nel 1971 i quali constatarono che l’elettroforesi, lo studio della composizione delle basi e dell’omologia sul DNA portarono a risultati che in genere non si discostano da quelli ottenuti con le tecniche sierologiche.

Secondo Whitcomb (1981) l’elettroforesi come la determinazione dei valori di citosina e guanina presenti nel materiale nucleico delle cellule di Spiroplasma, consentiranno di riconoscere le differenze tra le specie incluse nel genere citato. Anche le tecniche sierologiche sono di grande rilevanza ed hanno consentito come sottolinea Whitcomb (1981) di individuare nove sierogruppi nell’ambito del genere Spiroplasma.

La sierologia è di fondamentale importanza per lo studio dei micoplasmi come è riportato nel paragrafo sottostante.

Reazioni sierologiche.

I test sierologici sono preceduti dalla fase di purificazione dei micoplasmi dai tessuti vegetali delle piante ospiti. Questo processo risulta alquanto complesso per la fragilità delle strutture pleomorfiche dei micoplasmi e per il basso titolo che raggiungono nei tessuti infetti (McCoy et al., 1989). Pertanto risulta difficile come sostengono McCoy et al., (1989) ottenere materiale purificato, necessario per la produzione di anticorpi da utilizzare a scopo diagnostico. Alcuni successi sono stati conseguiti con la produzione di anticorpi policlonali preparati a partire da antigeni purificati da piante infette (Sinha, 1974; Clark et al., 1983; Caudwell et al., 1982; Boudon – Padieu et al., 1986; Sinha e Chiykowski, 1984, 1986; Cousin et al., 1987). Anticorpi policlonali prodotti contro i micoplasmi purificati dai tessuti di cicaline infette, sono stati utilizzati per l’identificazione diagnostica dei micoplasmi agenti della flavescenza dorata della vite (Caudwell, 1982). Poiché i micoplasmi antigeni sono purificati da insetti, gli anticorpi hanno scarsa reazione con gli antigeni delle piante sane (es. proteine delle piante che possono comportarsi come antigeni e quindi falsare le diagnosi). Nonostante le problematiche menzionate queste tecniche sono di fondamentale importanza per l’identificazione di specie e sottospecie come sottolineano Davis e Whitcomb, (1971) e Lovisolo (1973). Lovisolo (1973) ritiene che le varie tecniche sierologiche differiscono grandemente in sensibilità e specificità. In particolare l’agglutinazione ed il test di precipitazione e la fissazione del complemento sono secondo Lovisolo (1973) poco specifiche per l’identificazione dei micoplasmi anche se sono state ampiamente utilizzate come sottolineano Davis e Whitcomb (1971). I saggi più specifici sembrano essere secondo Davis e Whitcomb, (1971) e Lovisolo (1973) l’immunofluorescenza, l’inibizione della crescita su substrati nutritivi, l’inibizione metabolica, le prove per gli anticorpi neutralizzanti e l’inibizione dell’azione citopatica. Lovisolo (1973) afferma inoltre che le ricerche volte a dimostrare relazioni sierologiche incrociate fra batteri e micoplasmi sono fallite o considerate inadeguate. Giannotti e Vago (1971) non hanno trovato relazioni sierologiche fra l’agente della fillodia del trifoglio e diversi micoplasmi animali o saprofiti.

La sierologia classica che prevede l’impiego di anticorpi policlonali non ha contribuito in maniera rilevante secondo Conti e Barba (1996) alla caratterizzazione dei micoplasmi. Ciò è stato essenzialmente dovuto alla difficoltà di produrre antisieri specifici per il patogeno e non presentanti reazioni verso le proteine delle piante ospiti (15)

(15) Alcuni antigeni che si trovano nei micoplasmi risultano affini ad antigeni che si trovano nelle piante, rendendo problematica la classificazione dei micoplasmi con le tecniche sierologiche. Questa affermazione era già stata evidenziata quattordici anni prima da Caudwell nel 1982.

Ancora una volta sottolineiamo come la complessità del ciclo dei micoplasmi, che avviene parte nelle piante e parte negli animali vettori, ostacola il lavoro dei tassonomisti.

L’avvento degli anticorpi monoclonali ha aumentato la possibilità di utilizzare la sierologia per rilevare almeno in alcune matrici vegetali, la presenza di micoplasmi (Conti e Barba, 1996). Esistono a questo proposito esempi di risultati positivi nell’evidenziare la presenza di micoplasmi in viti affette da flavescenza dorata o in pomodori con sintomi di "stolbur".

Coltivazione in vitro ed in vivo.

La ricerca dei mezzi di coltura per i micoplasmi ha sempre trovato difficoltà, principalmente per la sensibilità alla lisi tipica dei microrganismi non protetti da parete cellulare. La regolazione della pressione osmotica del substrato come anche quella del pH hanno un ruolo fondamentale. I substrati per micoplasmi si distinguono secondo quanto riportato da Lovisolo (1973) in tre tipi: quelli adatti a micoplasmi parassiti di animali, quelli adatti a micoplasmi parassiti di vegetali e quelli adatti a micoplasmi saprofiti. I precursori di lipidi sono necessari per i micoplasmi parassiti di animali e vegetali. La maggiore difficoltà sostiene Lovisolo (1973) è quella di fornire materiale lipidico non tossico. Generalmente si impiegano sieri di mammiferi e fosfolipidi.

La coltivazione in vitro su mezzi nutritivi artificiali sia dei micoplasmi degli animali sia di quelli isolati dall’uomo, è effettuata da tempo (Belli, 1970).

I mezzi nutritivi impiegati sotto forma di brodi o di terreni di coltura agarizzati contengono sia sostanze comunemente usate in batteriologia (infusi di carne come ad esempio cuore di bovino, siero di cavallo, siero di bovino), sia altre sostanze definite con il termine anglosassone "supplement" (Davis e Whitcomb, 1971) che si sono rivelate particolarmente adatte per i micoplasmi (estratto di lievito, acidi nucleici, peptoni). Queste ultime hanno un’efficacia variabile in funzione della loro natura intrinseca, dei metodi di preparazione e delle concentrazioni utilizzate nei mezzi di coltura (Davis e Whitcomb, 1971). Lo stesso composto sottolineano Davis e Whitcomb, (1971) può stimolare lo sviluppo di alcune specie di micoplasmi ed inibirne altre. Madoff (1960), Morton e Roberts (1967) verificarono che in alcuni casi i substrati agarizzati rendevano più facile il primo isolamento anche se alcune qualità di agar mostrarono un’azione inibente sui micoplasmi. Madoff (1960), Morton e Roberts (1967) provarono sperimentalmente che alcune specie si sviluppano solamente in condizioni di anaerobiosi o rispondono positivamente alla crescita a seguito dell’aggiunta di anidride carbonica. Smith (1964) riscontrò che l’effetto della composizione dell’atmosfera sulla crescita dei micoplasmi variava in funzione dalle caratteristiche del substrato. Morton e Roberts (1967) osservarono che alcuni micoplasmi si sviluppavano come colonie satelliti intorno a colonie di altri batteri definiti da loro stessi "nurse bacteria".

Ai terreni di coltura si aggiunge generalmente un antibiotico (per lo più penicillina) al fine di impedire o limitare l’inquinamento da batteri (Belli, 1970; Davis e Whitcomb, 1971) e acetato di tallio (può avere un’azione tossica nei confronti di alcune specie di micoplasmi) per inibire lo sviluppo de i funghi (Lovisolo, 1973). Madoff (1960) si accorse che la penicillina poteva favorire la crescita delle forme L’ dei batteri con conseguente inquinamento delle colture dei micoplasmi. Gli agenti inquinanti possono crescere più rapidamente dei micoplasmi parassiti che in tali condizioni a volte perdono la loro patogenicità. Simili difficoltà possono essere riscontrate nel tentativo di isolare i patogeni dalle piante infette.

L’osmolarità, il pH, la concentrazione ed il rapporto tra i nutrienti, il contenuto in vitamine, la temperatura sono fattori molto importanti che andrebbero presi in attenta considerazione per isolare i micoplasmi dagli insetti e dalle piante (Davis e Whitcomb, 1971). Thomas et al., (1969) riscontrarono che le esigenze di crescita dei micoplasmi coltivati su substrati agarizzati potevano essere superiori rispetto a quelle necessarie con i mezzi di coltura liquidi. Su terreni agarizzati i micoplasmi formano piccole colonie circolari con il tipico aspetto delle uova fritte (dovuto alla parte centrale più densa ed a quella periferica diafana) con diametro variante dai 10 ai 600 micron. L’aspetto, delle colonie può essere di ausilio nel riconoscimento delle varie specie (Belli, 1970). Hayflick et al. (1965) si accorsero che nei substrati contenenti un’alta concentrazione di siero si formavano elevate concentrazioni di saponi di calcio e magnesio che inducevano la comparsa di pseudocolonie del tutto simili alle vere colonie prodotte dai micoplasmi (16)

(16) Nel campo della ricerca scientifica occorre, secondo noi, essere consapevoli che le interpretazioni dei fenomeni possono essere fuorvianti, se le osservazioni sono condotte in modo superficiale ed acritico. Nel caso specifico un fenomeno fisico simula un fenomeno biologico.

Le pseudocolonie prodotte dai saponi, costituite da elementi capaci di accrescersi in dimensioni, sono in grado di aumentare di numero simulando la crescita delle colonie formate dai micoplasmi. Oltre ai substrati acellulari sono state impiegate anche colture in vivo (es. cellule embrionale o tessuti viventi) con risultati a volte superiori (Eaton, 1965). I problemi incontrati inizialmente sono stati a volte superati modificando la composizione dei nutrienti del substrato. L’incapacità più volte riscontrata di mantenere in vita le subcolture portò Hayflick e Stanbridge (1967) ad ipotizzare che in alcune specie di micoplasmi isolati dall’uomo dovevano essere presenti alcuni nutrienti endogeni che consentivano l’isolamento, ma non il mantenimento del patogeno nelle colture successive.

Lovisolo (1973) afferma che i substrati messi a punto per i micoplasmi degli animali non sono risultati adatti, da soli, alla coltivazione dei micoplasmi dei vegetali. Giannotti et al (1969 b), Giannotti e Vago, (1971), Saglio et al. (1971) suggerirono di integrare i substrati per micoplasmi degli animali con estratti di piante, di insetti vettori e di lieviti. Questi ultimi sono stati impiegati anche per mettere a punto i substrati per la coltivazione dei micoplasmi parassiti degli animali.

Belli (1970) riporta che Chen e Granados, (1970) siano riusciti a coltivare in vitro micoplasmi isolati dai vegetali (così erano definiti in quel periodo, in quanto il termine fitoplasmi sarà coniato molto più tardi) impiegando terreni nutritivi simili a quelli usati per i micoplasmi degli animali, diversi però per alcuni costituenti e per il pH (i micoplasmi dei vegetali sembrano richiedere saccarosio e pH inferiore a 7).

Chen e Granados (1970) avrebbero soddisfatto secondo Belli (1970) i postulati di Koch isolando i micoplasmi da piante di mais, coltivandoli in vitro, iniettandoli nell’insetto vettore Dialbulus elimatus ed infine inoculandoli in piante sane nelle quali sarebbero comparsi i sintomi della malattia. Belli non specifica se dalle piante inoculate sia stato reisolato il patogeno. Quest’ultima fase della sperimentazione è però indispensabile per la verifica dei postulati di Koch (17)

(17) Dalla lettura degli articoli non si comprende con chiarezza se i postulati di Koch sono stati applicati correttamente. Non sappiamo se si tratta di una omissione voluta dall’autore (Belli) o una semplice dimenticanza (!). Ribadiamo che nessuna fase del procedimento ideato da Koch può essere omessa per la classificazione dei microrganismi.

Allo stesso traguardo sarebbero giunti Hampton et al (1969) studiando una striatura necrotica del pisello. Belli (1970) evidenza che la malattia suddetta sarebbe determinata dall’infezione combinata di micoplasmi e virus del mosaico dell’erba medica. Questa affermazione solleva molte perplessità poiché i virus sono parassiti obbligati e non si possono coltivare in vitro.

Belli (1970) conclude che

"per tutte le altre malattie oggi considerate micoplasmosi si è potuto soltanto rilevare la costante o frequente associazione fra presenza di sintomi e presenza di micoplasmi nelle piante. Tuttavia tenuto conto che in questi casi si è generalmente accertato che si tratta di malattie infettive e che nelle piante malate non si è riusciti a mettere in evidenza altri agenti patogeni al di fuori dei micoplasmi, è più logico considerare questi ultimi come i responsabili delle malattie."

Afferma inoltre che

"la possibilità di coltivazione in vitro rappresenterebbe una grande tappa nello studio dei micoplasmi dei vegetali, in quanto renderebbe possibile la loro produzione in quantità ragguardevoli e quindi la più facile applicazione di raffinate tecniche d’indagine (microscopia elettronica, sierologia, analisi biochimiche), capaci di mettere in evidenza anche lievi differenze esistenti tra le varie specie di micoplasmi e quindi di dare avvio ad una classificazione anche dei micoplasmi dei vegetali, analoga a quella già ben delineata per i micoplasmi degli animali e dell’uomo."

Lovisolo (1973) auspica

"che anche altre micoplasmosi siano sottoposte alla verifica dei postulati di Koch che per questi microrganismi è verosimilmente più importante che per altri patogeni. Ciò anche per la possibilità di avere lo sviluppo di micoplasmi saprofiti nei tessuti vascolari delle piante in esame. (18)"

(18) Sottolineiamo ancora una volta che la impossibilità attuale di coltivare in vitro i micoplasmi e la presenza di alcune specie saprofitarie nelle piante, rendono arduo il compito dell’isolamento e della classificazione delle specie fitopatogene.

Gli spiroplasmi ad azione fitopatogena sono stati per contro isolati e coltivati in laboratorio con relativa facilità. Il primo substrato di coltura per l’isolamento e la crescita in vitro degli spiroplasmi fu preparato da Saglio et al. (1971; 1972). Il mezzo individuato con la sigla SMC, simile a quelli predisposti per i micoplasmi, contiene alcune sostanze particolari quali il sorbitolo per aumentare l’osmolarità, DNA, saccarosio e fruttosio. Successivamente fu formulato un nuovo substrato di coltura (BSR) a partire da quello menzionato, riducendo la concentrazione del siero di cavallo dal 20% al 10% ed eliminando l’apporto di DNA e di estratto di lievito fresco (Bové e Saillard, 1979). I mezzi liquidi sono stati impiegati per lo studio delle reazioni biochimiche che caratterizzano il metabolismo degli spiroplasmi, mentre i substrati solidi sono stati utilizzati per il conteggio delle colonie (Saglio et al., 1973). I terreni di coltura menzionati con composizione relativamente semplice, risultarono inidonei per la crescita del spiroplasma agente del "corn stunt" (Whitcomb, 1981). Per giungere ad una soluzione del problema Williamson e Whitcomb (1975) e Jones et al. (1977) prepararono substrati più complessi (M1 e M1A), ritenuti dagli autori idonei per la crescita di tutte le specie di spiroplasmi. Whitcomb (1981) affermò in una pubblicazione posteriore che il substrato M1A è impiegato di routine per la coltivazione in vitro di molte specie di spiroplasmi. Si riporta la frase alla lettera scritta dall’autore:

"The M1A medium is now used routinely for many applications."

Lo studio della composizione chimica dell’emolinfa degli insetti che ospitano gli spiroplasmi in alcune fasi del ciclo, consentì di mettere a punto substrati di coltura adatti per la coltivazione dei spiroplasmi fastidious (Tully et al., 1977; Williamson e Whitcomb, 1975). Il substrato SP–4 contenente colture di tessuti di insetti siglati CMRL – 1066 o "Schneider’s Drosophila medium", fornisce un’eccezionale ricchezza di nutrienti, utile anche per la crescita di spiroplasmi parassiti dei vertebrati. Liao e Chen (1977) riuscirono a coltivare lo spiroplasma agente del "corn stunt" sul substrato siglato C-3G, che ha una composizione chimica meno complessa rispetto ai mezzi di coltura citati. Tale substrato contiene infatti soltanto un brodo di coltura di base siglato PPLO, saccarosio e siero. Whitcomb (1981) sostiene tuttavia che i substrati di coltura ricchi di nutrienti possono facilitare il primo isolamento dei spiroplasmi fastidious. In alcuni casi come sottolineano Williamson e Poulson (1979), substrati di coltura complessi come M1A risultano adatti al mantenimento dell’elicità e della vitalità di spiroplasmi estratti dalla drosofila, ma non alla loro moltiplicazione. Il successo di un isolamento dipende oltre che dal substrato anche da altri fattori come ad esempio la qualità dell’inoculo (Whitcomb, 1981). Chen e Davis (1979) sostengono che l’isolamento risulta facilitato ricorrendo all’impiego di linfa spremuta da gemme di piante ospiti nelle prime fasi della espressione sintomatica della malattia.

Whitcomb, (1981) sostiene che il mantenimento delle colture microbiche risulta in genere più semplice rispetto al primo isolamento. Il rallentamento o l’arresto della crescita delle colture microbiche in vitro può essere correlato all’esistenza di virus parassiti degli spiroplasmi, alla presenza di plasmidi (Ranhand et al., 1980), o alla modifica della composizione chimica del substrato.

La coltivazione in laboratorio degli spiroplasmi ha permesso di verificare i postulati di Koch e di caratterizzare i microrganismi dal punto di vista fisiologico e biochimico (Pollini e Giunchedi, 1984).

In conclusione si può affermare che la coltivazione in vitro a tuttora risulta possibile solo per gli spiroplasmi. La ricerca sui micoplasmi risulta invece seriamente complicata dalla perdurata impossibilità di conservarli in coltura axenica che consentirebbe studi di caratterizzazione, comparativi e tassonomici, molto più precisi di quanto sia oggi possibile. A questa difficoltà si è ovviato mantenendo gli isolati di micoplasmi in vivo sia in piante ospiti, tra le quali eccelle per durata e duttilità la pervinca del Madagascar (Catharantus roseus), sia in insetti vettori allevati in condizioni controllate (Conti e Barba, 1996). Per la conservazione in vivo dei micoplasmi, McCoy et al. (1989), Conti e Barba (1996) sostengono che l’uso dei vettori naturali è preferibile agli altri mezzi di trasmissione, indubbiamente più agevoli, ma inadeguati a garantire una pressione selettiva costante sugli isolati in studio (ottenibile invece attraverso il ciclo naturale pianta – vettore – pianta) e quindi a preservarne le caratteristiche originarie. Alcune caratteristiche quali ad esempio la trasmissibilità dei micoplasmi attraverso i vettori potrebbe essere persa senza l’impiego prolungato di essi. Per conservare a lungo periodo una singola linea del patogeno si può ricorrere alla tecnica del congelamento "freezing" a (- 70 ºC). Anche quando la vitalità dei micoplasmi non si può mantenere è possibile procedere alla liofilizzazione o al congelamento di piante infette o di parti di esse. In tal modo si eseguono al momento opportuno i test sierologici sui patogeni privi di vita (McCoy et al., 1989). Anche il DNA estratto dai micoplasmi può essere conservato per ulteriori studi.

Belli(1970) afferma che sono necessari ulteriori studi per fornire un quadro più preciso sulle affinità e differenze che intercorrono tra i micoplasmi dei vegetali e degli animali.

Tecniche di ingegneria genetica.

Nell’ultimo decennio lo sviluppo di tecniche molecolari ha aperto la via al rilevamento dei micoplasmi in estratti di piante e vettori ospiti e alla loro identificazione. L’analisi di geni altamente conservati del DNA micoplasmico fra cui quelli del RNA ribosomale (16S), della regione intergenica spaziatrice (da 16S a 23S), di proteine ribosomali, ha fornito le basi per la classificazione dei micoplasmi e ha consentito lo sviluppo di procedimenti diagnostici che prevedono come è indicato da Conti (2001) le seguenti fasi:

Estrazione del DNA

Amplificazione polimerasica a catena del DNA micoplasmico mediante sua denaturazione (apertura della doppia elica), riproduzione dei singoli filamenti e successiva riassociazione. La reazione ha luogo alternando diverse temperature e utilizzando l’enzima DNA polimerasi in presenza di oligonucleotidi sintetici, detti iniziatori di reazione (primers). Ripetuta più volte, essa consente di amplificare la regione di DNA compresa tra i primers in modo esponenziale.

Analisi del polimorfismo di lunghezza dei segmenti di restrizione, che viene realizzata mediante la digestione dell’amplicone con enzimi di restrizione che tagliano il DNA in corrispondenza di particolari sequenze nucleotidiche, frammentandolo in segmenti di varia lunghezza il cui profilo, opportunamente rilevato, caratterizza nel suo insieme il DNA originario. Il confronto dei diversi profili evidenzia il grado di omologia e quindi di affinità genetica tra i vari micoplasmi , consentendo di distinguerli e classificarli.

La diagnosi dei micoplasmi secondo Conti (2001) incontra ancora non poche difficoltà per le caratteristiche intrinseche delle infezioni quali ad esempio la localizzazione floematica dei micoplasmi, la concentrazione bassa e la distribuzione irregolare che si riscontra in molte piante colpite. Il quadro tassonomico pertanto è in continua evoluzione con l’affinamento delle metodologie molecolari e la caratterizzazione di nuovi tratti dei genomi dei micoplasmi.

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bibliografia Glossario