Reazione a catena della polimerasi (PCR)

 

 

 

La PCR ("Polymerase Chain Reaction") [Mullis et al., 1986; Mullis e Faloona, 1987] è una tecnica biomolecolare che permette l'amplificazione esponenziale in vitro di sequenze di acidi nucleici. Per poter applicare questa tecnica è necessario conoscere la sequenza delle regioni terminali della sequenza bersaglio; la loro conoscenza permette la sintesi dei due inneschi oligonucleotidici (detti "primer") necessari per la reazione [Mullis e Faloona, 1987]. In realtà esistono applicazioni della PCR alla caratterizzazione genetica e alla selezione genetica assistita da marcatori molecolari dove si utilizzano "primer" molto corti a sequenza casuale che sono in grado di amplificare sequenze genomiche in modo arbitrario senza conoscere necessariamente l’esatta sequenza di bordo della regione amplificata [Caetano Annoles, 1991].

Biochimica della reazione a catena della polimerasi

I componenti essenziali della miscela di reazione della PCR sono una DNA polimerasi termostabile, "primer" oligonucleotidici, deossiribonucleotidi trifosfati (dNTPs), ioni magnesio, DNA bersaglio.

La reazione di amplificazione prevede tre fasi [Innis et al., 1990] (Fig. 17):

1. Denaturazione (separazione): il ds-DNA bersaglio (DNA a doppia catena) è denaturato alla temperatura di circa 95°C ed è convertito in DNA a singola catena .

2. Appaiamento ("annealing"): i "primer" oligonucleotidici complementari alle due estremità 3' della sequenza da amplificare ibridano con i due filamenti denaturati ad una temperatura che è orientativamente 5 °C più bassa della Tm dei "primer" stessi; la loro sequenza è orientata in modo da poter guidare la polimerizzazione del DNA (senso 5'® 3') nel tratto compreso tra le due regioni a cui essi si associano.

3. Estensione: i "primer" oligonucleotidici, in presenza dei quattro deossinucleotidi trifosfati e di una DNA polimerasi, vengono estesi ognuno in direzione dell'altro ma su due diverse catene complementari portando alla sintesi di due molecole di ds-DNA copie della regione bersaglio delimitata dagli inneschi. Il ciclo può essere ripetuto anche fino a 60 volte, portando all'amplificazione esponenziale del DNA bersaglio ("target DNA") secondo la formula:

 

N=(1 + e )n

dove, N = numero di copie amplificate al termine della reazione, e = efficienza dell'amplificazione, n = numero di cicli di amplificazione, dove e ha un valore spesso compreso tra 0,7 e 0,8 [Saiki et al., 1985].

 

 

Variabili biochimiche

Esistono numerose variabili che condizionano la reazione di amplificazione. La polimerasi utilizzata nelle prime versioni della tecnica è stata la DNA polimerasi I, di Escherichia coli, termolabile, dotata di attività ottimale alla temperatura di 37°C. Successivamente, per evitare di aggiungere al mix di reazione l’enzima dopo ogni stadio di denaturazione, è stato introdotto l'uso di DNA polimerasi termostabili, resistenti alla temperatura di denaturazione e con un’attività ottimale a 72°C (Taq DNA polimerasi; Tth DNA polimerasi; Pwo DNA polimerasi; Vent DNA polimerasi) [Boeringer Mannheim, 1995; New England Biolab, 1995].

La Taq DNA polimerasi, la più utilizzata è capace di resistere a temperature molto elevate (97°C) ed in grado di funzionare fino da temperature di 65°C [Innis et al., 1989]. La concentrazione di questo enzima può oscillare tra 1 e 5 unità per 100 m l di reazione, infatti si è osservato che con concentrazioni troppo elevate si possono accumulare prodotti di reazione aspecifici, se , invece, la concentrazione dell’enzima è troppo bassa, difficilmente si raggiungono rese ottimali di amplificato [Lawyer et al., 1989].

La concentrazione ottimale dei "primer" varia da 0,1 a 0,5 m M: concentrazioni più elevate possono promuovere l’accumulo di prodotti aspecifici, che determinano un notevole calo in resa dei prodotti desiderati [Steffan e Atlas, 1991].

I deossiribonucleotidi trifosfati devono essere in concentrazioni che variano, per ciascun nucleotide, da 20 a 200 m M, ed è consigliabile utilizzare per i quattro nucleotidi la stessa concentrazione, questo infatti minimizza gli errori di incorporazione [Innis et al., 1988].

Essenziale per la PCR è lo ione magnesio (Mg 2+), utilizzato in concentrazione variabile tra 0,5 e 2,5 mM, che influenza l’attività dell’enzima, aumentando la temperatura di denaturazione del DNA bersaglio, condiziona l’attacco dei "primer", stabilizzando l’ibrido molecolare e forma complessi solubili con i dNTPs che sono i veri substrati riconosciuti dalla DNA polimerasi [Steffan e Atlas, 1991].

Numerosi sono i tamponi utilizzati in PCR, ma la scelta deve essere fatta in funzione delle condizioni di reazione: caratteristiche del DNA bersaglio e dei "primer", ciclo di reazione.

Si utilizza in generale un tampone TRIS-HCl 10-50 mM con un pH compreso tra 8.3 e 9 a 25 °C (il pH del TRIS cala al crescere della temperatura). Per facilitare l’appaiamento dei "primer" sul DNA denaturato si può aggiungere alla miscela di reazione fino a 50 mM di KCl. A concentrazioni superiori a 50 mM, KCl però essere un inibitore della Taq polimerasi [Innis et al., 1988].

La Taq polimerasi è un grossa proteina idrofoba che tende a precipitare in soluzione acquosa. L’aggiunta di detergenti non ionici (Tritonâ X-100, Tweenâ 20, fino ad una concentrazione finale di 0,01%), di gelatina o albumina bovina (100 m g/ ml) o 2-mercaptoetanolo (fino ad una concentrazione finale di 10 mM) stabilizza la Taq DNA polimerasi [Innis et al., 1990].

Variabili termodinamiche e disegno dei "primer"

Ciascuna delle tre fasi della reazione di amplificazione è caratterizzata da strette condizioni termodinamiche (temperatura e tempo di ciascuna fase), dalle quali dipende la riuscita del ciclo di amplificazione. Una delle cause di insuccesso della PCR è l’incompleta denaturazione del DNA bersaglio e dei prodotti di reazione. La temperatura e la durata di questa fase dipendono dalla natura del DNA bersaglio: lunghezza, composizione in (G+C)%. Condizioni tipiche di denaturazione sono 94-95°C per 30-60 secondi o 96-97°C per 15 secondi [Innis e Gelfand, 1990]. Temperature più elevate si rendono necessarie nel caso di bersagli particolarmente ricchi in GC; si deve però tenere presente che temperature eccessive determinano la perdita di attività della polimerasi: la Taq polimerasi ha un emivita che diminuisce progressivamente con l’aumentare della temperatura (> 2 ore a 92,5°C, 40 minuti a 95°C e 5 minuti a 97,5°C) [Innis e al. 1990 ].

La temperatura e la durata della fase di "annealing" dipendono dalla concentrazione, dalla lunghezza e composizione in basi dei "primer". Dal punto di vista strutturale un "primer" ideale deve avere una lunghezza compresa tra i 18 ed i 28 nucleotidi ed una composizione in G +C tra il 50 % ed il 60%. Queste condizioni garantiscono una temperatura di fusione (Tm= "melting temperature") tra i 50 e gli 80°C secondo la formula semplificata di determinazione della Tm ) [Wallace et al., 1979]:

Tm = 4 ( G+C ) + 2 ( A + T )

Si deve evitare l’uso di "primer" che presentino complementarità all’estremo 3’, perché in tal caso si possono formare dei dimeri tra i "primer" che riducono la resa del prodotto desiderato; si devono inoltre evitare "primer" con sequenze palindrome e con strutture secondarie estese [Innis et al., 1990]. Una considerazione generale è che i "primer" devono essere sufficientemente complessi affinché la probabilità di ibridare sequenze diverse da quella voluta sia estremamente bassa [Coyne et al., 1992]. La scelta dei "primer" è semplificata con l’uso di programmi computerizzati capaci di ricercare la sequenza ottimale, per caratteristiche chimico-termodinamiche, rispetto al DNA bersaglio [Rychlik e Rhoads, 1989].

Uno schema generale prevede l’uso di una temperatura di accoppiamento ("annealing") (Ta) circa 5°C più bassa della Tm dei due "primer" utilizzati [Innis et al., 1990], inoltre l’incremento di 1°C, in ciascun ciclo, della temperatura di "annealing" porta ad un aumento di specificità di amplificazione e di resa per prodotti di lunghezza inferiore a 1 Kb [Rychlik et al., 1990]. Una conseguenza dell’uso di una temperatura di "annealing" troppo bassa è che uno o entrambi i "primer" possono ibridarsi con sequenze diverse da quella bersaglio (amplificazione non- specifica) determinando quindi un calo in resa del prodotto desiderato; al contrario una temperatura più alta determina una riduzione dell’ibridazione dei "primer" sul DNA bersaglio e quindi della resa [Coyne et al., 1992]. Temperature comprese tra i 55° e i 72°C forniscono i migliori risultati e ad una concentrazione ottimale dei "primer" (0,2 m M) la reazione di legame richiede 30 secondi [Kim e Smithies, 1988].

I tempi di estensione dei "primer" dipendono dalla lunghezza e dalla concentrazione delle sequenze bersaglio e dalle temperature di reazione. Classicamente l’estensione si effettua a 70°-72°C, temperatura ottimale per la Taq DNA polimerasi, a tale temperatura, 20 secondi di estensione sono sufficenti di frammenti più piccoli di 500 bp, mentre 40 secondi sono sufficienti per frammenti lunghi fino a 1.2 Kb [Boehringer Mannheim, 1995]. A 72°C la Taq DNA polimerasi incorpora dai 30 ai 100 nucleotidi al secondo e questo numero è fortemente condizionato dal pH, dalla concentrazione salina del mezzo, nonché dalla natura del DNA bersaglio. Un periodo di estensione di un minuto a 72°C è sufficiente a produrre una sequenza di circa 2 Kb [Innis e Gelfand, 1990], prodotti più lunghi richiedono tempi di estensione più lunghi: 3 minuti sono sufficienti per amplificati di 3 Kb. In generale tempi di estensione più lunghi possono essere necessari soprattutto nei primi cicli della reazione, se la quantità del DNA bersaglio risulta essere troppo bassa, e nei cicli finali quando la concentrazione dei prodotti è in eccesso rispetto a quella dell’enzima [Saiki et al., 1988].

Il numero di cicli di amplificazione è un fattore condizionante la resa di amplificazione. Tale numero dipende da vari parametri, e principalmente dalla quantità di DNA bersaglio di partenza (Tab. V).

Tab. V - Relazione tra numero di cicli di amplificazione e quantità iniziale di DNA bersaglio.

N° di molecole bersaglio vs. N° cicli

3. 105   

  25-30

1,5. 104   

  30-35

1. 103   

 35-40

50   

  40-50

 

Ottimizzazione della PCR

In generale condizioni che incrementano la resa di amplificazione portano ad una ridotta specificità di amplificazione cioè a rischi di amplificazioni non specifiche. Le condizioni ottimali di reazione sono quelle che assicurano un bilanciamento tra queste due opposte tendenze [Roux, 1995].

Tab. VI - Lo schema riporta le condizioni che favoriscono la specificità, spesso opposte a quelle che portano ad un’elevata resa di reazione (dove ­ e ¯ simboleggiano rispettivamente incremento o diminuzione ).

 

Ottimizzazione del pH

 

Ottimizzazione del "disegno" dei "primer"

¯

[Mg2+]

¯

[dNTP]

¯

[DNA polimerasi]

¯

Numero dei cicli

­

Tasso di variazione delle temperature da fase a fase

­

Temperatura di "annealing"

¯

Concentrazione dei "primer"

¯

Degenerazione dei "primer"

­

Efficienza della denaturazione del DNA bersaglio

 

Applicazioni diagnostiche della PCR

Nella diagnosi fitopatologica la PCR offre diversi vantaggi rispetto a metodi diagnostici tradizionali [Henson e French, 1993]: gli organismi parassiti non obbligati non necessitano di essere coltivati in vitro prima di essere rilevati mediante PCR; la tecnica è estremamente sensibile, rapida e versatile; la selettività può essere accresciuta o ristretta in funzione della scelta dei "primer", facilitando il rilevamento di un singolo patogeno o più membri appartenenti ad un medesimo gruppo tassonomico. L’amplificazione in vitro del DNA mediante reazione a catena della polimerasi può essere utilizzata sia come strumento di rilevamento da materiale contaminato o infetto sia come strumento di identificazione di microrganismi purificati. Nel primo caso il DNA o RNA bersaglio sono stati amplificati con successo partendo da materiali di difficile manipolazione come l’emolinfa e la saliva di insetti, acque superficiali, suolo, tessuti vegetali sani o malati. In questi casi le sequenze bersaglio sono generalmente purificate o trattate in modo da rimuovere inibitori della DNA polimerasi (polisaccaridi, composti fenolici, composti umici) in modo da massimizzare la sensibilità anche se spesso una semplice bollitura del campione può essere un semplice pretrattamento del campione prima dell’amplificazione. Qualora si renda necessario eliminare gli inibitori della PCR si ricorre frequentemente a trattamenti con resine a scambio cationico o con polivinilpirrolidone che lega i composti fenolici. Nel secondo caso invece l’analisi può essere compiuta su preparati genomici purificati oppure su colture pure tal quali o dopo lisi mediante bollitura od alcali.

La PCR è stata applicata per il rilevamento di tutti i principali gruppi di organismi fitopatogeni (viroidi, virus, fitoplasmi, batteri, funghi e nematodi) sfruttando come bersaglio sequenze specifiche del DNA o RNA del microrganismo (sequenze genomiche ottenute da librerie random, geni di virulenza o patogenicità, geni ribosomiali, sequenze di plasmidi specifici, ecc.) [Henson e French, 1993]. Recentemente la PCR è stata combinata con metodi di ibridazione al fine di aumentare la sensibilità delle analisi ("PCR dot blot", ibridazione di "reverse dot blot", "PCR-ELISA") o la specificità, fino a livelli di singole differenze di basi nucleotidiche ("LCR").

La PCR è stata applicata estesamente anche per la caratterizzazione genetica dei microrganismi fitopatogeni: tra i marcatori molecolari diagnostici basati su PCR troviamo i "RAPD", i polimorfismi "Rep-PCR", "IGS-PCR", ed "AFLP" [Milgroom, 1997].

Oltre alla fitopatologia, la PCR ha naturalmente trovato numerose applicazioni nella diagnosi clinica medico-veterinaria, nelle metodologie del DNA ricombinante, nel mappaggio genomico, nell’analisi delle impronte genetiche, che ne hanno fatto uno dei più comuni e potenti strumenti nello studio della biologia molecolare dei geni [Sambrook et al., 1989].

 

Scheda dalla tesi di Annalisa Sandrini: "Amplificazione in vitro di sequenze genomiche di Erwinia amylovora e rivelazione chemiluminescente dopo ibridizzazione del DNA in soluzione (PCR-ELISA)"

Bibliografia