Purificazione del DNA genomico batterico

 

 

 

 

Nei batteri il materiale genetico consiste in una doppia elica di DNA organizzato in un cromosoma anulare, con lunghezza compresa tra le 500 e le 5000 Kb (migliaia di paia di basi) e di uno o più elementi extracromosomici dotati di replicazione autonoma detti plasmidi, di lunghezza compresa tra alcune Kb a 200 Kb [Joset e Guespin-Michel, 1995]. I componenti base del DNA sono: residui di 2' deossiribosio, residui fosfati e quattro basi eterocicliche, due purine (adenina e guanina) e due pirimidiniche (citosina e timina). Ogni elica del DNA è costituita da un residuo di 2' deossiribosio legato ad un gruppo fosfato il quale unisce la posizione 3' di uno zucchero con quella 5' del gruppo zuccherino vicino. Ciascuna delle quattro basi è attaccata in posizione 1' dello zucchero. Le due eliche, complementari l'una all'altra, sono unite mediante ponti ad idrogeno che si instaurano tra le basi: l'adenina forma due legami ad idrogeno con la timina, la guanina forma tre legami con la citosina. La doppia elica è ulteriormente stabilizzata da legami idrofobici addizionali tra le basi. Il DNA è un polimero che presenta un alto rapporto lunghezza-diametro che lo rende estremamente sensibile alle rotture durante le fasi di purificazione in soluzione. Una caratteristica peculiare del DNA è la presenza di due zone con caratteristiche antitetiche di polarità: una zona idrofobica centrale dovuta alle basi puriniche e pirimidiniche e quindi estremamente poco solubile in acqua, ed estese zone idrofile esterne ad elevata carica negativa, dovuta ai gruppi fosfato deprotonati a pH fisiologico, le quali rendono il DNA abbastanza solubile in acqua [Dale, 1994]. La molecola del DNA può essere lineare o circolare. In questo ultimo caso essa va incontro a modificazioni topologiche che ne stabilizzano la struttura tridimensionale mediante avvolgimenti positivi o negativi della doppia elica. Si possono così distinguere forme topologiche del DNA rilassate o superavvolte dotate di proprietà chimico-fisiche diverse. Condizioni estreme di pH, denaturano reversibilmente la doppia elica del DNA ma non le piccole molecole circolari superavvolte. Questa proprietà risulta particolarmente importante per la purificazione del DNA plasmidico, comune vettore negli esperimenti di clonaggio. Prolungati trattamenti con HCl portano alla depurinazione (degradazione chimica delle basi puriniche) del DNA, proprietà sfruttata negli esperimenti di "Southern blotting" per diminuire la lunghezza del DNA da trasferire su filtro ed aumentare la resa di trasferimento [Dyson, 1991]. La denaturazione della doppia elica può essere ottenuta anche mediante il riscaldamento, e da qui deriva l'importanza del fattore temperatura negli esperimenti di ibridazione molecolare e PCR. La reversibilità della denaturazione dipende dalla velocità con cui le condizioni termiche e chimiche variano: brusche inversioni delle condizioni rendono improbabile la reazione bimolecolare di rinaturazione, lasciando la doppia elica spaiata dalla sua complementare [Polsinelli et al., 1988]. La denaturazione viene facilitata dalla presenza di ammidi a basso peso molecolare come formammide (fino al 50%) ed urea (fino ad 8 M) oppure da elevate concentrazioni di cationi monovalenti (fino a 3 M) che stabilizzano la singola elica di DNA [Boncinelli e Simeone, 1991].

La purificazione del DNA batterico coinvolge inizialmente la rottura della parete e delle membrane. La lisi può avvenire mediante trattamenti fisici (ultrasuoni) o chimici con enzimi come lisozima, protenasi K e pronasi, capaci di degradare la parete cellulare attaccando diversi suoi componenti (proteine, peptidoglicani). Un trattamento usuale di lisi è quello con detergenti anionici come SDS (sodio lauril solfato), N-lauril sarcosina o detergenti non ionici, come il Triton X-100â , capaci di degradare le membrane e liberare il contenuto cellulare in soluzione [Towner, 1991]. Le soluzioni di lisi contengono oltre al principio litico numerosi additivi che servono a stabilizzare il DNA durante il processo di purificazione. Tra di essi il tampone Tris-HCl è usato per mantenere il pH tra 7,5 e 8,0. Dal momento che il DNA è una molecola che può facilmente rompersi durante il trattamento di lisi, nelle soluzioni di lisi si trovano frequentemente polialcoli (saccarosio, glucosio, glicerolo, sorbitolo) che minimizzano le rotture stabilizzando la molecola del DNA, mentre per ridurre l'attività delle nucleasi endogene si impiegano chelanti di ioni bivalenti (soprattutto ione magnesio) come EDTA (acido etilendiamminotetracetico) o EGTA (acido etilen glico-bis-(2-aminoetilen) tetracetico) [Old e Primrose, 1994].

Dopo il trattamento di lisi, la soluzione contiene essenzialmente una miscela di DNA, RNA, peptidi ed altre molecole (specialmente polisaccaridi). Numerosi sono i trattamenti di deproteinizzazione disponibili, inclusi trattamenti enzimatici con proteasi (spesso concomitanti alla lisi) o estrazioni con solventi organici (generalmente fenolo tamponato e/o cloroformio) che denaturano ed allontanano le proteine dal DNA [Towner, 1991].

In alcune specie batteriche la produzione di polisaccaridi extracellulari può costituire un ostacolo alla purificazione del DNA genomico, per cui si sono messe a punto diverse strategie per separare questa componente. La più comune prevede l'utilizzo di resine in grado di legare DNA o polisaccaridi in base alla concentrazione di cationi monovalenti [Towner, 1991].

La soluzione acquosa contenente DNA genomico ad alto peso molecolare può venire ulteriormente purificata mediante ultracentrifugazione in gradiente di cloruro di cesio, specialmente quando la successiva manipolazione del DNA richiede elevati standard di purezza (creazione di librerie genomiche, sequenziamento, ecc.) [Brown, 1991]. Negli ultimi anni sono andate diffondendosi resine a scambio anionico in grado di legare DNA, componenti di parete e del citoplasma che vengono successivamente eluiti con tamponi a forze ioniche crescenti [Brown, 1991]. Tali sistemi forniscono livelli di purezza comparabili alla ultracentrifugazione in gradiente anche se con costi molto più elevati.

La preparazione di DNA comunque purificata viene concentrata mediante precipitazione con alcoli monovalenti a basso peso molecolare (etanolo, isopropanolo) in presenza di cationi monovalenti (Na+, K+, Li+) a concentrazioni comprese tra 0.1 e 0.3 M [Maloy et al., 1996]. Il DNA genomico viene conservato generalmente in tamponi a temperature comprese tra +4°C e -20°C.

Il DNA genomico purificato in soluzione si presenta fortemente degradato da un punto di vista fisico a causa degli stress a cui è sottoposto durante l'estrazione. Danni alla singola elica ("nick") o rotture della doppia elica ("shearing") per rotture dei legami fosfodiesterici sono molto comuni nelle preparazioni di DNA genomico in soluzione [Brown, 1991]. La popolazione di molecole risultati ha una lunghezza casuale compresa tra le 30 kb e le 200 kb [Tait, 1995] e in un sistema elettroforetico a campo elettrico costante migra come una unica banda equivalente a circa 50 kb [Brown, 1991].

Scheda dalla tesi di Annalisa Sandrini: "Amplificazione in vitro di sequenze genomiche di Erwinia amylovora e rivelazione chemiluminescente dopo ibridizzazione del DNA in soluzione (PCR-ELISA)"

Bibliografia