Supplementi al Dizionario di Chimica e Chimica Industriale
Metodi immunologici di analisi. ELISA

 

 

Introduzione

L’utilizzo degli anticorpi, una classe di glicoproteine del siero, prodotte dai linfociti B degli animali a sangue caldo in risposta a molecole estranee di varia natura (antigeni) e di grosse dimensioni molecolari (> di 5000), iniziò nella diagnosi delle malattie umane per poi estendersi alla diagnosi fitopatologica [Hampton et al, 1990].

 

Produzione di anticorpi policlonali

L’anticorpo può essere prodotto contro cellule batteriche vive o morte (uccise al calore per 30 minuti in modo da esporre le molecole che costituiscono la parete), contro specifici prodotti batterici come tossine o enzimi e contro frazioni cellulari specifiche (ribosomi, oligosaccaridi, lipoproteine, glicoproteine) [Hampton et al., 1990]. L’animale più utilizzato per la produzione di anticorpi è il coniglio che risulta essere meno problematico da gestire in laboratorio. Alcuni batteri patogeni sono tossici anche per il coniglio soprattutto se iniettati per endovena (shock anafilattico), ciò può essere evitato con immunizzazioni sottocutanee o intramuscolare [Hampton et al., 1990].

La produzioni di anticorpi policlonali (contenenti anticorpi reattivi contro più di un epitopo e per questo multispecifici) ad alto titolo, dipende da diversi fattori tra cui uno dei più importanti è la presenza degli antigeni nel sangue per un periodo continuato di diverse settimane. Ciò può essere ottenuto in diversi modi:

- con iniezioni endovenose multiple con dosi crescenti di antigene (con tempi brevi tra un’iniezione ed un’altra per evitare la distruzione dell’antigene da parte del sistema immunitario).

- con iniezioni sottocutanee o intramuscolari: tale metodica garantisce un lento rilascio dell’antigene nel sangue assicurando, con un minor numero di iniezioni di richiamo, una presenza continua per diverse settimane [Hampton et al., 1990].

Generalmente le procedure di immunizzazione più rapide portano ad un minor titolo ma ad una maggior specificità dell’antisiero.

Le principali globuline ottenibili con i normali metodi sono IgM ed IgG. Le prime sono le più adatte per le reazioni di agglutinazione; le seconde sono invece idonee per i test ELISA ed IFAS [Hampton et al., 1990].

La determinazione del titolo di un anticorpo è data dalla massima diluizione del siero alla quale è ancora osservabile una reazione anticorpo-antigene (Ab-Ag). Un buon siero ha un titolo di 1:500 - 1:1000 anche se non è eccezionale ottenere anticorpi con titolo 1:6000 [Hampton et al, 1990] .

Produzione di anticorpi monoclonali

Per anticorpi monoclonali si intende una popolazione omogenea di anticorpi prodotti da un clone cellulare (ibridoma) ottenuto per fusione di cellule immunoproduttrici con cellule di mieloma maligno, dotate di specificità verso un solo epitopo dell’antigene immunizzante [Pelckzar et al., 1982; Eisen, 1993]. La fusione tra i linfociti B (provenienti dalla milza e dai linfonodi di un animale immunizzato) e il mieloma di topo, viene ottenuta per intervento di un promotore di fusione di membrana, come il polietilenglicole. Le cellule ibride, o ibridomi, vengono coltivate in vitro dove continueranno a produrre anticorpi monospecifici e a moltiplicarsi. Il terreno su cui sono allevati gli ibridi è di tipo selettivo conosciuto con il nome di HAT, che proprio per la sua composizione, inibisce la crescita sia dei mielomi che delle cellule della milza non fuse, ma non dell’ibridoma che completa le due linee parenterali. Gli ibridomi vengono sottoposti a screening per la ricerca degli anticorpi specifici cercati e quelli scelti vengono avviati alla conservazione o alla produzione in massa [Grange et al., 1987].

Applicazioni diagnostiche in fitopatologia

L’immunodiagnostica fitopatologica rappresenta l’applicazione delle reazioni immunologiche Ab-Ag per la caratterizzazione, l’identificazione, la diagnosi dei ceppi batterici o delle cellule batteriche fitopatogene a seconda che vengano applicate su colture pure ottenute da tecniche di isolamento diretto oppure su materiale vegetale sintomatico o asintomatico oggetto di accertamento [Hampton, 1990].

Le principali metodiche di immunodiagnosi in batteriologia sono [Mazzucchi, 1995; Girotti et al., 1985]:

l’agglutinazione su vetrino

l’agglutinazione del Latex

l’immunodiffusione su agar

i saggi ELISA (diretti ed indiretti)

i saggi IFAS (diretti ed indiretti)

Queste tecniche presentano diversi gradi di sensibilità e laboriosità di esecuzione, mentre in generale la specificità dipenderà più strettamente dall’uso di anticorpi monoclonali o policlonali [Mazzucchi, 1995].

Agglutinazione su vetrino (SAT, "Slide Agglutination Test")

Questa metodica immunodiagnostica, prevede il verificarsi della reazione Ab-Ag tra una sospensione densa (> 10 9 cellule/ml) di cellule batteriche e diverse diluizioni di antisiero specifico. La reazione che avviene su un vetrino da microscopia ottica, si rende manifesta quando ogni cellula batterica espone più di un epitopo in modo da dare luogo ad aggregati spaziali complessi [Mazzucchi, 1995]. La reazione positiva (osservabile entro 1, 2 o 5 minuti in condizioni ottimali di rapporto anticorpo-antigene e temperatura) non è adatta per la diagnosi su materiale asintomatico.

Agglutinazione del Latex

Si tratta di una tecnica assai simile alla precedente ma più sensibile (fino a 106 cellule / ml). In questo caso, gli anticorpi sono adsorbiti in granuli di Lattex (polistirene) e la reazione positiva è costituita da flocculi di sferette con un incremento della soglia di visibilità [Hechemy e Michaelson,1984].

Immunodiffusione su agar

Questa tecnica è basata sulla capacità di un anticorpo ed del rispettivo antigene, posti in zone differenti di una superficie di agar, di diffondere liberamente fino ad incontrarsi formando bande opache di precipitazione nel punto in cui i due fronti di diffusione si incontrano. La più semplice applicazione di tale principio è il metodo di Ouchterlony [Eisen, 1993].

Questa tecnica è particolarmente utile per ricercare nei diversi antigeni la presenza di componenti identici o in grado di dare reazioni crociate [Grange et al, 1987].

Colorazione di immunofluorescenza (IFAS, "ImmunoFluorescent Antibody")

Questa tecnica ancora oggi rimane, in molti casi, la più utilizzata tra le tecniche disponibili in diagnostica batterica poiché la reazione è applicabile anche in presenza di poche cellule batteriche (10-2- 10-3 batteri ml-1) , sia su colture pure che su campioni vegetali [Mazzucchi, 1995]. La metodica si basa sulla capacità di composti fluorescenti (generalmente isotiocianato di fluoresceina: FITC) di legarsi agli anticorpi. Quando l’Ab coniugato si lega alla cellula batterica, esso permette l’osservazione della stessa al microscopio a fluorescenza usando una sorgente UV e filtri opportuni in base al colorante utilizzato [Pelczar et al. 1982].

Esistono due tecniche principali attraverso cui si esegue l’IFAS [Grange et al., 1987]:

  1. colorazione diretta, dove il composto fluorescente viene coniugato all’anticorpo specifico per il batterio oggetto della diagnosi;
  2. colorazione indiretta, dove ad essere coniugato con il composto fluorescente è un anticorpo specifico per la regione Fc dell’anticorpo specifico per il batterio.

Saggio di immunoassorbimento con enzima coniugato (ELISA,"Enzyme-Linked Immunosorbement Assay")

I test ELISA sono di uso corrente in fitovirologia [Clark e Adams, 1977; Bar-Joseph e Garnsey, 1980] ma meno diffusi in fitobatteriologia: essi consentono lo screening di un numero elevato di campioni in breve tempo (tipicamente 24-48 h) e con parziale o totale automazione della procedura [Schaad, 1979].

In questi test, eseguiti su piastra di polistirene ad alta capacità di assorbimento per le proteine [Lehtonen e Viljanen 1980], gli anticorpi vengono coniugati covalentemente con enzimi, formando complessi che conservano sia le capacità immunologiche che quelle catalitiche in grado di trasformare specifici substrati. Questi ultimi, modificando le loro proprietà colorimetriche, permettono la visualizzazione- misurazione della reazione positiva [O’Beirne e Cooper, 1979].

La più significativa caratteristica dei saggi di immunoassorbimento è la capacità di determinare fitopatogeni utilizzando concentrazioni molto più

basse di quelle utilizzabili con i classici metodi di immunoprecipitazione. Un’altra caratteristica dell’ELISA è la sua versatilità, cioè la sua abilità nel determinare antigeni di diverse morfologie e dimensioni [Clark, 1981].

Gli svantaggi principali dei test ELISA sono l’impossibilità di osservare le cellule direttamente come nell’IFAS, la possibilità di osservare falsi positivi e negativi e la bassa sensibilità (104- 105 cellule /ml ) rispetto all’IFAS [Clark, 1981; Mazzucchi, 1995].

I protocolli possibili sono numerosi ma tutti riconducibili a due classi principali, ELISA diretto, ELISA indiretto [Clark, 1981].

1) ELISA diretto: la cellula batterica (antigene) viene fatta adsorbire direttamente sulla superficie dei pozzetti oppure più comunemente, si procede prima alla sensibilizzazione dei pozzetti con anticorpi batterio specifici, incubandoli per alcune ore (2-6 h) a 37° C (DAS-ELISA: "double antibody sandwich ELISA"). In quest’ultimo caso, si asporta poi l’eccesso di anticorpo con appositi tamponi e si aggiunge il campione da testare, incubando in genere per una notte. Se sono presenti antigeni omologhi, questi si legheranno ai pozzetti sensibilizzati. L’aggiunta dell’anticorpo specifico coniugato con un enzima (fosfatasi alcalina, perossidasi di rafano) [Korpraditskul et al. 1979] e la successiva aggiunta, dopo i necessari lavaggi, del substrato colorimetrico specifico per l’enzima, darà origine, nel caso di responso positivo, ad una modificazione dello spettro di assorbimento del substrato con la possibilità di registrare l’assorbimento a una data lunghezza d’onda [Clark, 1981].

Fig. 11

ELISA indiretto: in tale metodica si ricorre all’antigene adsorbito sui pozzetti (ELISA in fase solida), anche se vi sono procedure in cui esso viene intrappolato da anticorpi specifici (DASI-ELISA: "double antibody sandwich indirect"; Fig. 11). In questo caso gli anticorpi coniugati sono anticorpi anti frammenti Fc degli anticorpi specifici per il batterio [Clark, 1981]. La procedura prevede in seguito, una rivelazione-misurazione analoga alla metodica precedentemente descritta.

In entrambi i casi l’attività enzimatica, dosata in condizioni standard, sarà direttamente proporzionale alla quantità di antigene presente [Grange et al., 1987]. I vantaggi derivanti dalla relativa semplicità strumentale, dalla elevata sensibilità analitica e dall’ampia disponibilità di reazioni chemiluminescenti dotate di elevata specificità, hanno portato a un loro utilizzo anche nel campo dei saggi immunologici [Pazzagli, 1996] ed in particolare nell’ELISA.

L’utilizzo di anticorpi monoclonali ha migliorato notevolmente l’accuratezza della tecnica: l’utilizzo, nella tecnica DASI-ELISA, di anticorpi monoclonali ottenuti da topo (o ratto) come anticorpi sonda, abbinato all’uso di anticorpi policlonali specifici fissati su piastre e anticorpi di coniglio anti-topo (o ratto) coniugati con l’enzima per la rivelazione sequenziale degli anticorpi sonda ha portato ad una riduzione significativa di false reazioni positive [Mazzucchi, 1996; Gorris et al., 1995].

 

Scheda dalla tesi di Annalisa Sandrini: "Amplificazione in vitro di sequenze genomiche di Erwinia amylovora e rivelazione chemiluminescente dopo ibridizzazione del DNA in soluzione (PCR-ELISA)"

Bibliografia