Ibridazione degli acidi nucleici

 

 

 

Cinetiche di ibridazione e calcolo della Tm

L’ibridazione e la marcatura degli acidi nucleici rappresentano una componente base di molte tecniche di biologia molecolare applicate all’isolamento, quantificazione di specifiche sequenze di acidi nucleici ed allo studio della loro organizzazione, localizzazione intracellulare, espressione, regolazione. Applicazioni più specifiche riguardano la diagnosi delle malattie infettive e delle malattie ereditarie [Old e Primrose, 1994].

La tecnica si basa sulla formazione di coppie di basi stabili (ibrido) tra la sonda a DNA (o RNA) e la sequenza nucleotidica bersaglio (bersaglio); perché avvenga questo è necessario che sia il bersaglio che la sonda, nel caso in cui questa sia costituita da DNA bicatenario, siano convertite in due singole catene tramite passaggio di denaturazione al calore o trattamento con alcali o con altri agenti destabilizzanti come la formammide [Dyson, 1991].

La stabilità termica dell’ibrido è espressa dalla temperatura di fusione Tm ("melting temperature") definita come la temperatura alla quale metà del DNA (o ibrido) è presente in forma denaturata, cioè in catene singole [Boehringer Mannheim, 1992].

La Tm di un ibrido in soluzione dipende dalla concentrazione salina, dalla composizione in basi e dalla presenza di agenti denaturanti. Gli effetti di questi parametri sono combinati in un’unica equazione [Mienkoth e Wahl, 1984]:

Tm = 81,5 +16,6 (log M) + 0,41 (% G+C) - 0,61 (% form) -500/L*

(* altri autori suggeriscono un valore di 675/L oppure 820/L per l’ultimo termine dell’equazione)

dove M è la molarità dei cationi monovalenti, (% G+C) è la percentuale di guanine e citosine nel DNA, (% form) è la percentuale di formammide nella soluzione, e L è la lunghezza in basi appaiate del DNA. Quest’ultimo parametro risulta essere poco significativo per ibridi di lunghezza superiore a 500 bp. Per ibridi di lunghezza inferiore a 50 bp il termine 500/L risulta inappropriato e la Tm viene calcolata mediante l’equazione [Wallace et al., 1979]:

Tm = 2 x (n° di AT appaiate) + 4 x (n°di GC appaiate)

La concentrazione salina ha un effetto significativo sulla stabilità dell’ibrido: i cationi monovalenti infatti, determinano una riduzione della repulsione elettrostatica tra le due eliche, stabilizzando l’ibrido. In soluzioni di NaCl, l’interazione tra adenina (A) e timina (T) è più debole di quella tra guanina (G) e citosina (C), per questo motivo il calcolo della Tm tiene conto solo della % di G+C per valori compresi tra 30-75 % di G+C [Marmur e Doty, 1961].

La Tm può essere variata notevolmente effettuando la reazione in presenza di reagenti che destabilizzano i legami ad idrogeno come la formammide [Schmeckerpeper e Smith, 1972; Bonner et al., 1967; Hutton, 1977; Schildkraut e Lifson, 1965].

E’ stato stimato che la Tm per una sequenza casuale di DNA viene ridotta di circa 0,6°C per ogni % di formammide (v/v) [Meinkoth e Wahl, 1984]. Gli effetti della formammide sulla Tm degli ibridi DNA-RNA o RNA-RNA sono meno chiari e possono variare significativamente con la sequenza [Casey e Davidson, 1977].

In un’approssimazione sommaria la Tm di un ibrido DNA-DNA viene ridotta di 1°C per ogni % di malaccoppiamenti di basi (1 coppia di basi non corrispondente su 100 bp) [Bonner et al., 1973]; questa riduzione in realtà dipende fortemente dalla composizione in basi della sequenza degli errati accoppiamenti e dalla loro distribuzione nell’ibrido [Marmur e Doty, 1961; Wallace et al., 1979].

L’ibridazione è una reazione con cinetica di secondo ordine a due stadi: inizialmente i singoli filamenti di acidi nucleici si incontrano casualmente in soluzione e, se essi presentano sequenze complementari, si appaiano per formare una breve regione a doppia elica (nucleazione). In seguito tale regione si estende con un meccanismo a cerniera, estremamente veloce, per successivo appaiamento di nucleotidi, fino a formare una lunga doppia elica [Britten e Davidson, 1985]. La velocità di nucleazione dipende dalla collisione casuale delle sequenze complementari e da essa dipende la velocità di ibridazione [Young e Anderson, 1985]. La quantità di ibrido formato durante l’ibridazione è determinata principalmente dalla concentrazione della sonda, dalla durata del processo di ibridazione e dalla velocità di ibridazione [Dyson, 1991].

I parametri che influenzano la stabilità dell’ibrido, e che generalmente influenzano anche la velocità di ibridazione ,sono [Wetmur, 1976; Dyson, 1991; Boehringer Mannheim,1992]:

Variando accuratamente questi parametri è possibile determinare le condizioni di "stringenza" cioè le condizioni capaci di ridurre al minimo le reazioni di ibridazione non specifica: si parla di "alta stringenza" quando le modalità di ibridazione sono tali da consentire la formazione di ibridi molecolari perfettamente appaiati, al contrario, se invece è alto il grado di malaccoppiamenti si parla di "bassa stringenza" [Dyson, 1991].

Sonde genetiche e metodi di marcatura

Le sonde genetiche sono costituite da sequenze di DNA o RNA capaci di appaiarsi mediante ibridazione ad una sequenza bersaglio complementare che si vuole ricercare [Gentilomi, 1990]. Le sonde possono presentare dimensioni variabili: dall’oligomero (con lunghezza £ 50 basi: oligosonde) a frammenti fino ad alcune migliaia di nucleotidi (in genere non superiori a 1,5 kb). Possono essere costituite da DNA (o RNA) a singolo filamento o da DNA bicatenario [Dyson, 1991]. Esse vengono costruite mediante clonazione del DNA in vettori genici, oppure per sintesi a partire da deossinucleotidi trifosfati [Gentilomi, 1990]. La costruzione delle sonde genetiche permette la loro applicazione nell’identificazione e isolamento di singoli geni direttamente nel materiale genetico [Swaminathan e Prakash, 1989] e per questo devono essere estremamente specifiche e dotate di un sistema rilevatore che è determinante per la sensibilità della sonda [Gentilomi, 1990]. La necessità di rivelare l’ibridazione tra il bersaglio genetico e la sonda, ha portato all’impiego di svariati tipi di sonde marcate, che si possono riunire in due gruppi principali , le sonde radioattive ("calde") e le sonde non radioattive ("fredde") [Gentilomi, 1990].

Le sonde radioattive, marcate cioè con radioisotopi, rappresentano le sonde più sensibili. La loro sensibilità dipende esclusivamente dalla radioattività specifica del radionucleotide incorporato: utilizzando nucleotidi marcati con 32P ad elevata attività specifica, si possono ottenere sonde in grado di rilevare quantità di DNA bersaglio inferiori al picogrammo [Brown, 1992]. Esistono tuttavia numerosi svantaggi e rischi nell’uso di sonde calde, che comprendono gli alti costi, i pericoli legati alla radioattività, le difficoltà di maneggiare queste sonde e, soprattutto, data la breve emivita del 32P, l’impossibilità di conservarle per lunghi periodi [Gentilomi, 1990].

Queste considerazioni hanno portato allo sviluppo di metodi di marcatura alternativi che non prevedono l’uso di traccianti radioisotopici [McInnes e Symons, 1989]. Le sonde marcate con traccianti non radioisotopici sono dette sonde non radioattive e sono tuttora oggetto di continui sviluppi e miglioramenti.

Le principali tecniche di marcatura per le sonde fredde prevedono modifiche chimiche dei nucleotidi in modo tale da introdurre in essi una molecola in grado di essere rilevata [Gentilomi, 1990].

Il primo marcatore non radioisotopico ad essere utilizzato, è stata la biotina (vitamina H) [Manning et al, 1975] (Fig.12).

Fig. 12

Questa vitamina idrosolubile, viene legata chimicamente alle basi puriniche (in posizione 6 dell’adenina e in posizione 4 della citosina) e pirimidiniche (in posizione 5 dell’ uridina), mediante un braccio spaziatore, le cui dimensioni ottimali sono di 11 atomi di carbonio, necessario per ridurre l’ingombro sterico della biotina e favorire l’inserimento enzimatico del nucleotide marcato nella molecola di DNA [Brigati et al., 1983].

Un’altra tecnica utilizzata per marcare le sonde genetiche si basa sulla modificazione chimica della molecola di acido nucleico introducendo un gruppo solfonico in posizione C-6 dei residui citidinici (sonde solfonate) [Lebachq et al., 1988] oppure legando N-acetossi-N-2-acetilaminofluorene in posizione C8 dei residui guanidinici [Tchen et al., 1984].

Un’ulteriore modifica chimica dei nucleotidi pirimidinici ha portato alla sintesi di nucleotidi marcati con digossigenina, un steroide isolato da piante di digitale (Fig. 13) [Kessler., 1990].

 

Fig. 13

La digossigenina è legata a nucleotidi uridinici in posizione 5 dell’anello pirimidinico mediante una catena spaziatrice di 11 atomi di carbonio [Boehringer Mannheim, 1991]. Altri autori hanno ottenuto sonde genetiche coniugando il DNA con enzimi quali fosfatasi alcalina o perossidasi [Renz e Kurz, 1984].

I metodi di marcatura delle sonde a DNA (o a RNA) prevedono l’incorporazione di nucleotidi marcati (per modificazione chimica o accoppiamento ad un enzima o apo-enzima) nel DNA sonda mediante reazioni enzimatiche [Gentilomi, 1991] (Tab. V).

 

Tab. V - Procedure di marcatura

Metodo vs. Enzima richiesto

 

fosforilazione dell’estremo 5’   

  T4 polinucleotide cinasi

Marcatura dell’estremo 3’   

  Transferasi terminale

"Nick-traslation"   

  DNA polimerasi I

"Random primer"   

  Enzima di Klenow

PCR   

  DNA polimerasi termostabili

Marcatura mediante "random primer"

Questo metodo prevede la neosintesi di un filamento di DNA marcato a partire da una molecola di DNA sonda bicatenario che funge da stampo [Gentilomi, 1991]. Affinché la reazione avvenga, è necessario che il DNA stampo sia in forma lineare e denaturato [Boehringer Mannheim, 1991]. L’enzima Klenow (un frammento della DNA polimerasi I di E. coli, privo dell’attività esonucleasica 5’® 3’) catalizza tale reazione in presenza di una miscela di esanucleotidi random, che fungono da innesco, e dei 4 deossinucleotidi (dei quali uno è marcato) [Feinberg e Vogelstein, 1984]. Questo metodo viene utilizzato per l’incorporazione di nucleotidi marcati con radioisotopi (32P, 35S) e con biotina e digossigenina con ottimi livelli di incorporazione (70-80 %) anche con piccole quantità di substrato [Mundy et al., 1990].

Marcatura con "PCR"

Questa nuova tecnica rappresenta un metodo alternativo di marcatura, molto versatile e semplice, comparabile alla tecnica mediante "random primer" in termini di efficienza di incorporazione (50-60%) [During, 1993]. Diversi protocolli sono stati messi a punto per l’incorporazione di nucleotidi digossigeninati e biotinilati via DNA polimerasi  termostabili: tutti hanno permesso di ottenere elevate rese di marcatura [During, 1993]. Un ulteriore vantaggio di questa tecnica è che non è necessario nessun isolamento e purificazione del DNA: la sequenza richiesta è direttamente amplificata e marcata in un’unica reazione di amplificazione partendo da qualsiasi fonte di DNA (DNA genomico, plasmidico, ecc.); inoltre, è possibile con questa metodica generare direttamente, sonde marcate a singolo filamento, semplicemente utilizzando un "primer" al posto di due [During, 1993].

Ibridazione su filtro

Questa tecnica di ibridazione su fase solida, rappresenta il metodo più conveniente per la rivelazione degli ibridi degli acidi nucleici [Meinkoth e Wahl, 1984]. Esistono in commercio diversi materiali con cui vengono prodotti filtri per l’immobilizzazione degli acidi nucleici [Dyson, 1991]:

nitrocellulosa , con un’alta capacità di legame (non covalente) per DNA a singolo filamento (80 m g cm-2 per filamenti di lunghezza superiore a 500 nucleotidi) ma particolarmente fragile e danneggiabile in presenza di acidi e alcali; Nylon, con un’alta capacità di legame (sia covalente che non) per singoli filamenti di acidi nucleici (> 400 m g cm-2) ma capace, a differenza della nitrocellulosa, di ritenere anche DNA a doppio filamento e oligonucleotidi; Nylon caricato positivamente: contengono gruppi amminici quaternari (carichi positivamente), presentano il vantaggio di legare covalentemente e irreversibilmente, in condizioni alcaline, il DNA denaturato.

L’ibridazione su filtro prevede cinque passaggi principali [Dyson, 1991]:

fissaggio dell’acido nucleico denaturato sul filtro: questa fase dipende, principalmente, dalle caratteristiche del filtro scelto (in genere si utilizza il fissaggio tramite trattamento al calore a 120°C per 30 min., o agli ultravioletti per 5 min.);

preibridazione: per bloccare i siti sulla membrana che potrebbero legare la sonda marcata e produrre un segnale di fondo;

ibridazione: durante la quale la membrana è fatta incubare, in specifiche condizioni di temperatura, agitazione e pH con la soluzione contenente la sonda marcata;

lavaggi: per rimuovere l’eccesso di sonda e quindi per definire la "stringenza" dell’ibridazione;

rivelazione dell’ibrido formato in base al tipo di sonda marcata utilizzata.

Diverse sono le tecniche che utilizzano l’ibridazione su filtro, tra esse si citano il "Southern blotting", il "Dot-blot" ed il " Reverse Dot-blot" [Dyson, 1991].

"Southern blotting" o trasferimento secondo Southern, dal nome del suo inventore [Southern, 1975]. Con questo termine si indica la tecnica di trasferimento del DNA, da qualsiasi tipo di gel a qualsiasi tipo di filtro [Dyson, 1991]. I frammenti di DNA separati per via elettroforetica in un gel, vengono trasferiti da questo, per diffusione capillare di una soluzione ad alta concentrazione salina, al filtro collocato direttamente sul gel e analizzati per ibridazione con una soluzione contenente una sonda marcata. Il segnale specifico risultante dell’avvenuta ibridazione non fornisce solo una misura della quantità di sequenza specifica nel campione, ma dà anche importanti informazioni riguardanti le dimensioni dei frammenti di DNA che trasportano la sequenza bersaglio [Dyson, 1991].

"Dot-blot". Metodologia che consiste nell’applicare una goccia o comunque volumi ridotti contenenti DNA o RNA direttamente su filtro che poi verrà ibridato con una sonda marcata [Boncinelli e Simeone, 1991]. Rappresenta il metodo più semplice per la misura della quantità di bersaglio presente nel campione esaminato. Questa tecnica permette uno "screening" efficace e rapido di molti campioni, soprattutto se si utilizza un apparato multipozzetto che consente il caricamento uniforme e rapido, in un unico filtro, di molti campioni. La quantità di bersaglio in ciascuno di essi è determinata, dopo ibridazione con la sonda marcata, dal confronto con il segnale prodotto da controlli positivi standard contenenti quantità note del bersaglio [Dyson, 1991].

"Reverse dot-blot". Questa metodica rappresenta una modifica del "dot-blot" tradizionale: sul filtro viene infatti fissata non più il bersaglio ma la sonda non marcata che viene fatta ibridare con una soluzione di ibridazione contenente il bersaglio precedentemente marcato [Kawasaki et al., 1993].

Ibridazione in soluzione e cattura

In questo tipo di reazione, il bersaglio denaturato e la sonda marcata vengono mescolate insieme in soluzione [Gentilomi, 1990]. La metodica è stata progettata per accelerare i tempi di ibridazione [Wolf et al., 1987]. Per questo tipo di tecnica, possono esserci problemi quando uno dei due campioni di acido nucleico (bersaglio e sonda), o entrambi, è in forma di duplex, infatti, si possono avere due tipi di ibridazione: la rinaturazione tra filamenti complementari originali, oppure l’ibridazione tra il la sequenza bersaglio e la sonda marcata; dal momento che le due reazioni sono in competizione, è difficile stimare il grado di ibridazione [Gentilomi, 1990]. Per ovviare a questi inconvenienti sono state progettate metodiche che sfruttano la cattura dell’ibrido formato su supporto solido [Edelstein, 1986; Syvanen et al., 1986; Boehringer Mannheim, 1997]. Un esempio di questa nuova metodica è rappresentato dalla "PCR-ELISA", tecnica che prevede la rivelazione degli ibridi formati in soluzione, grazie alla loro cattura su micropiastre [Gallinella et al., 1997; Poggi Pollini, 1997; Boerhringer Mannheim, 1997]. Mediante PCR si ottiene il prodotto marcato, per esempio con digossigenina, del campione; in seguito, i campioni marcati sono fatti ibridare in soluzione (in condizioni dipendenti dalla composizione e lunghezza della sonda e dal grado di omologia di questa con il bersaglio) con una sonda oligonucleotidica specifica marcata con biotina. Gli ibridi formati, si legano alla superficie dei pozzetti streptavidinati, grazie alla forte interazione biotina-streptavidina, possono così essere rivelati. (Fig. 14)

 

Fig. 14. Schema della cattura in pozzetto streptavidinato di un ibrido molecolare oligosonda biotinilata-amplicone digossigenilato (PCR-ELISA)

 

Metodi di rivelazione del segnale di ibridazione

I metodi di rivelazione degli ibridi con sonde marcate seguono strategie diverse a seconda del tipo di marcante utilizzato [Gentilomi, 1990]. Se vengono utilizzate le sonde radioisotopiche, la visualizzazione avviene tramite autoradiografia diretta, che offre una buona risoluzione, ed inoltre, l’immagine può essere quantificata mediante un densitometro che determina la quantità relativa di radioisotopo presente in ciascun punto del campione [Mundy et al., 1991].

Quando vengono utilizzate le sonde non radioisotopiche, l’ibrido viene rivelato mediante sistemi enzimatici semplici che trasformano substrati incolori e solubili, in prodotti colorati che precipitano nel punto stesso in cui è avvenuta l’ibridazione [Gentilomi, 1990]. Recentemente, inoltre, sono state sviluppate procedure di rivelazione chemiluminescente: in questo caso la rivelazione mediante sistemi enzimatici utilizza substrati chemiluminescenti in grado di dare emissione fotonica in seguito all’azione dell’enzima sul substrato, rivelabile mediante il luminometro, luminografo o con autoradiografia [Pazzagli, 1996; Guesdon,1992; During, 1993; Gallinella et al., 1997; Musiani et al., 1996; Musiani et al., 1991; Girotti et al., 1991].

Si distinguono due sistemi generali di rivelazione: uno diretto ed uno indiretto. Il primo si basa sul legame dell’enzima rivelatore o di un fluoroforo alla sonda a singolo filamento; il secondo si avvale invece di sistemi che sfruttano molecole intermediarie, in grado di riconoscere i marcatori fissati sulla sonda (es. anticorpo-aptene, proteina-coenzima), che a loro volta possono essere appaiati o meno ad enzimi di rivelazione (fosfatasi alcalina, perossidasi, b -galattosidasi) (Fig. 15) [Gentilomi,1990; Guesdon, 1992; Girotti et al., 1991].

Fig. 15

 

Anticorpi anti digossigenina coniugati con enzimi quali la fosfatasi alcalina o perossidasi vengono comunemente usati per la rivelazione di ibridi marcati con digossigenina [Mundy, 1991; Boerhinger Mannheim Biomedica, 1992]; anticorpi non coniugati anti-digossigenina e anticorpi secondari coniugati possono inoltre essere utilizzati per l’identificazione degli ibridi marcati con digossigenina [Boerhinger Mannheim Biomedica, 1992].

Gli ibridi marcati con biotina possono essere rivelati utilizzando anticorpi anti-biotina coniugati con enzimi [Boerhinger Mannheim Biomedica, 1992] ma più spesso, per l’alta capacità di legame con la biotina, vengono identificati utilizzando avidina o streptavidina coniugate con enzimi (fosfatasi alcalina o perossidasi) o fluorofori (rodamina, fluoresceina). La streptavidina, è una proteina, isolata dal batterio Streptomyces avidinii, analoga all’avidina e come questa, presenta una forte affinità con la biotina (Kd= 1015 M-1: 106 volte più grande della costante di affinità di qualsiasi coppia anticorpo e antigene) ma ha in più il vantaggio di ridurre i legami non specifici, grazie all’assenza di residui glicosidici responsabili di questi ancoraggi [Mundy et al., 1991; Wilchek e Bayer, 1990].

I principali enzimi che vengono utilizzati per la rivelazione indiretta sono la fosfatasi alcalina e la perossidasi [Gentilomi, 1990]. La fosfatasi alcalina può essere impiegata sia con substrati colorimetrici che chemiluminescenti come gli 1,2-diossetani che sono quelli più recenti ed utilizzati. Tra i principali substrati colorimetrici di tale enzima vi é il p-nitrofenil fostato sodico (pNPP) ed inoltre una miscela di 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BICP) e nitro blu di tetrazolio (NBT) convertiti dalla fosfatasi alcalina in un composto colorato insolubile, che permette l’identificazione di quantità di bersaglio dell’ordine 1- 0,1 pg. [Mundy, 1991; Boerhringer Mannheim Biomedica, 1992]

Anche la perossidasi essere utilizzata con substrati colorimetrici e chemiluminescenti (luminolo e derivati); tra i più recenti substrati colorimetrici, vi sono: l’ABTS (2,2’-azino-di(3-etil-benztiazolina-solfato), il DAB (diaminobenzidina (3-,4-,3-,4-tetraaminobifenile), il TMB (3,3’,5,5’ tetrametil benzidina) [Boehringer Mannheim, 1997].

 

Scheda dalla tesi di Annalisa Sandrini: "Amplificazione in vitro di sequenze genomiche di Erwinia amylovora e rivelazione chemiluminescente dopo ibridizzazione del DNA in soluzione (PCR-ELISA)"

Bibliografia