Elettroforesi degli acidi nucleici

 

 

 

Teoria dell'elettroforesi

L'elettroforesi è un processo elettrocinetico nel quale sostanze contenenti gruppi ionizzabili (ioni o macramolecole) migrano sotto l'azione di un campo elettrico [Cantaluppi e Righi, 1979].

Le macromolecole (in particolare i biopolimeri, acidi nucleici, proteine, lipidi complessi e carboidrati) si differenziano da semplici ioni essenzialmente per due fattori: possiedono maggiori dimensioni e hanno più cariche di uno ione. Questi due fattori influenzano in modo opposto la mobilità elettroforetica, nel senso che la mobilità diminuisce all'aumentare della dimensione e aumenta all'aumentare della carica.

La forza F esercitata su una particella con carica netta q posta in un campo elettrico di intensità E è espressa dall'equazione:

F = q x E

dove q = carica netta in coulomb, E = intensità del campo elettrico o gradiente di potenziale in volt/cm

Verrà raggiunto l'equilibrio quando le forze, F e F1, avranno uguale intensità e le varie particelle si muoveranno ad una velocità v costante. Si avrà allora:

F= F1      

q x E = f x v       v/E = q/f = u

Il rapporto v/E viene definito mobilità elettroforetica u ed avrà dimensioni cm sec-1/V cm-1 cioè cm2 sec-1 V-1.

Nella attuazione pratica [Andrews, 1991] l'elettroforesi si scosta dalle condizioni ideali descritta in quanto:

a) le macromolecole sono presenti in condizioni apprezzabili e non a diluizione infinita;

b) nel mezzo sono presenti ioni che hanno la duplice funzione di fornire la conducibilità elettrica alla soluzione e di esercitare un'azione tamponante.

La separazione elettroforetica può avvenire in fase libera o in una matrice, in tal caso la resistenza frizionale è influenzata da numerosi fattori inclusi non solo la viscosità del mezzo ma anche la densità e la dimensione dei pori della matrice e la dimensione e la forma delle particelle [Andrews, 1991].

La teoria della separazione elettroforetica degli acidi nucleici si basa sugli studi di Richards e Lecanidou, 1971 eseguiti su campioni di RNA e validi, in prima approssimazione, anche per il DNA. Il principio fondamentale è che molecole di acidi nucleici si muovono attraverso una matrice gelificata (tipicamente agarosio o poliacrilamide) di modo che la forza di trascinamento eguagli la resistenza frizionale offerta dal gel. Se chiamiamo Do il coefficiente di diffusione delle molecole in soluzione e uo la mobilità elettroforetica in assenza del gel, allora varrà la seguente relazione:

D/Do= u/uo=a

dove D ed u sono rispettivamente il coefficiente di diffusione e la mobilità elettroforetica nel gel.

Il coefficiente di ritardo a dipende dalle proprietà del gel (soprattutto la concentrazione del" monomero") e dalle dimensioni e forma delle molecole. In maniera semplicistica il passaggio degli acidi nucleici attraverso un gel può essere immaginata come se le molecole si facessero strada serpeggiando tra i pori del gel ("reptation theory") secondo meccanismi oggetto di intensi studi ma non completamente compresi [Andrews, 1991]. In pratica esistono diversi modelli per descrivere questo meccanismo di ritardo provocato dalle forze frizionali della matrice sulla molecola di DNA [Smith, 1989; Schawartz e Koval, 1989; Holmes e Stellwagen, 1990], ma nessuno risulta essere applicabile in maniera generalizzata.

Un'importante conclusione della trattazione teorica fatta da Richards e Lecanidou è che la mobilità dovrebbe variare linearmente con la radice quadrata della concentrazione di monomero nel gel, con migliori risoluzioni a più alte concentrazioni. Inoltre per molecole di DNA fino a 12 Kb circa può essere derivata una relazione empirica tra la mobilità e il logaritmo del peso molecolare [Richards e Lecanidou, 1971], mentre secondo altri autori esiste una relazione lineare tra peso molecolare e reciproco della mobilità che copre un intervallo maggiore del grafico semilogaritmico [Southern, 1979].

In generale bisogna mettere in evidenza come il movimento degli acidi nucleici sottoposti a migrazione elettroforetica risulti essere influenzato da numerose variabili e come i vari modelli descrittivi teorici proposti riescano a interpretare il comportamento delle molecole di DNA nel campo elettroforetico solo in situazioni particolari e limitate [Andrews, 1991].

Matrici di separazione

Acidi nucleici di dimensioni medie o piccole (10-400 bp) sono separate con gel di poliacrilamide mentre molecole più grandi sono separate in matrici di agarosio che presentano pori medi di dimensioni maggiori [Rickwood e Hames, 1990].

I gel di poliacrilamide sono formati mediante polimerizzazione vinilica di monomeri di acrilamide (CH2=CH-CO-NH2) in lunghe catene di poliacrilamide che sono legate tra loro mediante un co-monomero bifunzionale generalmente N,N'-metilen-bis-acrilamide (CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2) mediante una reazione radicalica iniziata da persolfato di ammonio, il quale produce radicali liberi di ossigeno mediante un meccanismo di catalisi basica, dove le basi sono generalmente ammine terziarie alifatiche come N,N,N,'N'tetrametilendiammina (TEMED). La dimensione media dei pori è determinata sia dalla concentrazione totale dei monomeri (T) che dalla % di co-monomero bifunzionale rispetto ai monomeri totali (C). Tipicamente T varia tra il 3,5 e il 20% mentre C varia dall'1 al 5%. La temperatura ottimale di polimerizzazione è tra i 25 e i 30°C, in assenza di ossigeno, potente inibitore della polimerizzazione; la reazione completa generalmente in 60 minuti.

I gel di agarosio (polisaccaride preparato per purificazione dell'agar) vengono utilizzati a concentrazioni tra lo 0,3 e il 4% in funzione della dimensione degli acidi nucleici che devono essere separati (Tab. III). L'agarosio ha la proprietà di fondere a 80°C e di gelificare a circa 40°C.

Agarosio (%) e Dimensioni di acidi nucleici lineari (kb)

0,3   

  1,0-70

0,5   

  0,7-45

0,8   

  0,4-20

1,0   

  0,3-10

1,2   

  0,2-8

1,5   

  0,2-6

2,0   

  0,1-5

Tab. III- Concentrazioni di agarosio richieste per la separazione di acidi nucleici di diverse dimensioni.

 

Sia nel caso dei gel di poliacrilammide che di agarosio, le matrici vengono preparate in un tampone a bassa forza ionica utilizzato anche come tampone di corsa elettroforetica [Andrews, 1991]. Si tratta di soluzioni saline (acetato di sodio o borato di sodio) di trimetilaminometano (Tris-HCl) tamponate a pH 8 circa che forniscono adeguata forza ionica e conducibilità al sistema elettroforetico. Sodio edetato viene aggiunto per complessare i cationi bivalenti, cofattori di numerose nucleasi [Rickwood e Hames, 1990].

La corsa di separazione avviene in celle con il gel disposto verticalmente od orizzontalmente a ponte tra i due elettrodi. I pozzetti vengono ricavati nel gel e collocati in prossimità del catodo (+). I campioni di DNA o RNA vengono caricati assieme ad un tampone contenente glicerolo o saccarosio, uno o più coloranti traccianti e sodio edetato [Rickwood e Hames, 1990]. Nel caso dei gel di poliacrilammide il campo elettrico massimo è di circa 20 V/cm, mentre nel caso dei gel di agarosio è di 5-10 V/cm [Andrews, 1991].

Metodi di rivelazione

Gli acidi nucleici separati nella matrice vengono visualizzati con differenti coloranti che si legano agli acidi nucleici secondo diversi meccanismi (interazioni idrofobiche, elettrostatiche, ecc.) e che sono in grado di essere rivelati sotto eccitazione da parte di sorgenti luminose di diverso tipo (UV, luce visibile) [Andrews,1991].

Uno dei coloranti più utilizzati è il bromuro di etidio, molecola organica aromatica planare, altamente cancerogena, in grado di intercalarsi tra le basi azotate e di emettere luce arancio se eccitata da radiazione UV con lambda compreso tra 254 e 306 nm. I gel vengono colorati dopo la corsa elettroforetica o durante la stessa. Questo colorante è in grado di evidenziare quantitativi di acidi nucleici fino a 50 ng [Old e Primrose, 1994].

Il blu di metilene rappresenta una alternativa al bromuro di etidio quando la concentrazione di acidi nucleici non è un fattore critico. L'unico vantaggio è rappresentato dalla scarsa tossicità della molecola utilizzata [Old e Primrose, 1994].

Quando gli acidi nucleici sono presenti a concentrazioni inferiori al nanogrammo si ricorre generalmente alla colorazione con nitrato di argento [Andrews, 1991]. Il metodo si basa sulla precipitazione di argento metallico sui polimeri di DNA dopo fissazione e riduzione di ioni Ag+ a livello dei gruppi fosfato. Il riducente utilizzato è costituito da tiosolfato di sodio in presenza di aldeide formica.

Attualmente sono in corso di studio metodiche di colorazione altamente sensibili che utilizzano nuovi coloranti fluorescenti alternativi al bromuro di etidio [Bio-Rad, 1997].

 

Scheda dalla tesi di Annalisa Sandrini: "Amplificazione in vitro di sequenze genomiche di Erwinia amylovora e rivelazione chemiluminescente dopo ibridizzazione del DNA in soluzione (PCR-ELISA)"

Bibliografia