La Chemiluminescenza

 

 

Aspetti generali della chemiluminescenza

La luminescenza consiste fondamentalmente nell’emissione di radiazioni luminose nel visibile o nel vicino visibile (lunghezza d’onda compresa nell’intervallo 300-800 nm) dopo che elettroni eccitati mediante una qualche fonte di energia, ritornano dallo stato eccitato a quello fondamentale. L’energia potenziale delle transizioni elettroniche all’interno degli atomi o delle molecole viene così liberata sotto forma di luce. Sono stati identificati molti tipi di luminescenza che differiscono tra loro per la fonte energetica responsabile della produzione o dell’immissione luminosa [Pinzani et al.1993; Roda et al., 1983].

Tra queste, per affinità di applicazione in campo scientifico, si trovano:

-la chemiluminescenza, nella quale lo stato elettronicamente eccitato è generato da una reazione chimica esoergonica [Pazzagli,1996];

-la bioluminescenza, nella quale la reazione chemiluminescente che ha luogo in sistemi biologici, coinvolge un componente proteico, in generale un enzima o una fotoproteina [Roda et al., 1983];

-l’elettrochemiluminescenza in cui la reazione chemiluminescente avviene in soluzione come risultante di reazioni di trasferimento di elettroni ad alta energia da una molecola ad alta energia;

-la chemiluminescenza ultra debole, in cui l’emissione spontanea ed estremamente debole di fotoni origina dal rilassamento di stati eccitati che derivano da numerosi processi cellulari [Pazzagli, 1996].

Si conoscono due tipi fondamentali di reazioni chemiluminescenti, diretta ed indiretta, definite anche di tipo I e tipo II [Pazzagli, 1996]. Nelle reazioni di tipo I la reazione genera la molecola primaria eccitata che è poi la responsabile della reazione luminosa. Nelle reazioni chemiluminescenti indirette il prodotto di reazione eccitato non è il reale emettitore di luce, ma trasferisce l’energia di attivazione ad un accettore che successivamente emette luce.

In generale, le reazioni chemiluminescenti richiedono fino a cinque componenti [Pazzagli, 1996]:

  1. il substrato o substrati chemiluminescenti, che reagiscono o si dissociano per formare la molecola nello stato elettronicamente eccitato, responsabile dell’emissione luminosa nelle reazioni di tipo I o del trasferimento di energia in quelle di tipo II;
  2. un accettore di elettroni, se si tratta di una reazione di ossidazione;
  3. un catalizzatore, come un enzima o uno ione metallico, necessari per ridurre l’energia di attivazione ed aumentare quindi la velocità di reazione;
  4. eventuali cofattori necessari per convertire uno o più substrati in una forma capace di reagire o interagire con il catalizzatore o necessari per la rottura del legame che darà origine alla specie molecolare emittente;
  5. un accettore di energia o di elettroni, per le reazioni di tipo II.

Entrambi i tipi di reazioni chemiluminescenti sono caratterizzati da intensità, colore, velocità di inizio e di decadimento dell’emissione luminosa ed infine dalla polarizzazione, se presente [Pinzani et al.,1993].

In generale, il segnale analitico prodotto dalle reazioni luminescenti ha un andamento che è funzione del tempo come riportato in Fig. 5.

Fig. 5. Andamento dell’emissione luminosa in funzione del tempo per una reazione con emissione costante (Raz. A) e per una reazione con rapido decadimento del segnale (Reaz. B). mV= millivolts; RLU= unità di luce relative.

Per qualche sistema chemiluminescente (adamantil dioxetano-fosfatasi alcalina), parametri operativi come concentrazione dei reagenti, pH, temperatura, agiscono sul segnale analitico dando luogo a cinetiche diverse [Pazzagli, 1996].

L’efficienza quantica di una reazione chemiluminescente (F CL), ossia il rapporto fra il numero di fotoni prodotti e le molecole che hanno reagito, è determinato dal rapporto di vari fattori:

Efficienza quantica = F CL = F Ch F SE F Em

dove:

F Ch = frazione di molecole che seguono la corretta via chimica.

F SE = frazione di molecole che dopo aver percorso la corretta via chimica passano allo stato eccitato.

F Em = frazione di molecole che, tornando allo stato fondamentale, trasforma fotoni l’energia chimica assorbita.

Da un punto di vista teorico una molecola di reagente può formare una molecola allo stato eccitato in grado di emettere un fotone, ma in realtà l’efficienza di emissione F CL varia da 0.1 a 0.9 nel caso di reazioni bioluminesenti e normalmente F CL non supera 0.1 nel caso della chemiluminescenza [Pazzagli, 1996; Roda et al., 1983].

Una caratteristica importante della chemiluminescenza è costituita dal tipo di segnale prodotto. Di norma, sia nel caso della fluorescenza che in radioluminescenza, il segnale da misurare si mantiene relativamente costante nel tempo [Pazzagli, 1996]. L’intensità di emissione luminosa è invece, nel caso della chemiluminescenza, una funzione della cinetica di reazione; di conseguenza una emissione fotonica costante può aver luogo solo in caso di cinetica di ordine zero cioè nel caso di una reazione a velocità costante. Questo si verifica solo in particolari condizioni [ad esempio nel sistema 1,2-diossetani-fosfatasi alcalina), e quando si verifica, la misura del segnale analitico risulta notevolmente semplificata, essendo direttamente correlata all’ampiezza del segnale. In altre casi la cinetica delle reazioni chemiluminescenti è temporalmente variabile nel senso che il segnale analogico è correlato in ogni istante al numero di fotoni prodotti in quell’istante; di conseguenza la curva di emissione è un’immagine dell’andamento della velocità di reazione in funzione del tempo. Il massimo di emissione luminosa è raggiunto al tempo tMAX , valore estremamente variabile, dipendentemente dal tipo di reazione e/o dai parametri analitici prescelti dalla reazione (pH, temperatura). L’emissione luminosa, una volta raggiunto il massimo, decade generalmente secondo una funzione di tipo esponenziale [Pinzani et al., 1993 ; Roda et al., 1983].

Principali reazioni chemiluminescenti

Sono ad oggi descritte molte centinaia di reazioni chimiche che producono luce nel campo del visibile e che possono essere riconducibili al fenomeno della chemiluminescenza. Tra di esse, verranno esaminate solamente le reazioni utilizzate .

1,2-diossetani

Gli 1,2-diossetani (Fig.6), sono molecole chemiluminescenti che subiscono una scissione in due frammenti carbonilici, uno dei quali si trova allo stato eccitato [Pinzani et al., 1993]. Fino a poco tempo fa, essi non potevano essere utilizzati nei biosaggi a causa della loro instabilità termica [McCapra, 1977]. Recentemente, comunque sono stati sintetizzati derivati stabili di 1,2-diossetani che possono essere attivati da reazioni chimiche o enzimatiche con emissione di luce e rese quantiche elevate [Schaap et al., 1987; Bronzetti et al., 1989].

Fig. 6

L’eccitazione del frammento carbonilico può essere rappresentata da un singoletto o da un tripletto e dipende dalla natura dell’1,2- diossetano. Per quanto riguarda il meccanismo che provoca la scissione degli 1,2-diossetani, sono stati proposti due diversi modelli interpretativi. Nel primo, proposto da Richardson e O’Neal, detto dei due radicali, la prima reazione è un processo reversibile che porta alla formazione di un composto diradicalico che procede spontaneamente verso la formazione dei due frammenti dicarbonilici [Richardson et al., 1974]. Nel secondo modello, proposto da Koo e Schuster, si prevede una simultanea rottura dei due legami con conseguente formazione dei due prodotti carbonilici [Koo e Schuster, 1977].

Per quanto riguarda i meccanismi che portano all’emissione chemiluminescente degli 1,2-diossetani, sono stati descritti in particolare due approcci molecolari. Il primo, descritto da Hummelen et al. nel 1987, prevede la termodecomposizione dell’adamantili-deneadamantane 1,2 diossetano in due molecole di adamantanone: questo processo è accompagnato dall’emissione luminosa [Hummelen et al., 1987]; il secondo è invece riconducibile alla semplice chemiluminescenza in soluzioni acquose e prevede la rimozione di un sostituente (per esempio la defosforilazione) che provoca la ridistribuzione elettronica. La conseguente frammentazione che ne deriva è accompagnata dall’emissione chemiluminescente. Questo è il caso del sale disodico del 4-metossi-4-(3-fosfatofenil)-spiro-(1,2-diossetano-3,2’-adamantano) (AMPPD o PPD) e del sale disodico del 3-(4-metossispiro{ 1,2-diossetano-3,2’- (5’-cloro) triciclo [ 3.3.1.13,7] decan } -4-il) fenil fosfato (CSPD), attualmente i diossetani più utilizzati per i biosaggi (Fig. 7)[Pinzani et al., 1993].

Nel tentativo di utilizzare i vantaggi già conseguiti con le metodiche immunoenzimatiche accoppiandoli a sistemi di rilevazione del segnale dotati di maggiore sensibilità e ampio range di lettura, sono stati fatti studi per valutare la possibilità di utilizzare substrati di enzimi capaci di dare luogo ad emissioni luminose. Tali ricerche hanno portato allo sviluppo di una serie di tecniche che accoppiano le potenzialità degli enzimi con quelle del segnale luminescente. In particolare, il sistema chemiluminescente fosfatasi alcalina-CSPD o AMPPD offre particolari vantaggi in termini di stabilità del segnale, sensibilità, e riproducibilità [Pazzagli, 1996; Roda et al., 1983; Girotti et al., 1985; Girotti et al., 1991]. Il CSPD così come l’AMPPD, in seguito a defosforilazione enzimatica da parte della fosfatasi alcalina, diventa un composto instabile che procede spontaneamente verso la decomposizione.

La quantità di fotoni emessi dipende anche dalla concentrazione dell’enzima. La velocità della reazione è influenzata dal pH infatti esso interferisce con lo stato di ionizzazione dei gruppi funzionali a livello dei siti attivi dell’enzima.

Nel caso della fosfatasi alcalina, il massimo dell’emissione chemiluminescente si ottiene in condizioni di pH alcalino. Per valori di pH molto basici (pH compreso tra 11 e 12) la reazione ha un andamento di tipo flash. Per questo è preferibile lavorare in condizioni di pH meno estreme, cioè con un valore di pH del tampone di reazione compreso tra 9,0 e 9,5.

Questo permette una certa stabilità del segnale che rimane pressoché costante per ore, anche se impiega alcuni minuti a raggiungere il plateau (valore costante).

La sensibilità del sistema chemiluminescente AMPPD-fosfatasi alcalina è estremamente elevata tanto da rilevare meno di 10-20 moli di enzima in soluzione o immobilizzato su membrana [Bronstein e al. 1989]. Grazie a questa eccezionale sensibilità, il sistema fosfatasi alcalina-AMPPD così come il sistema fosfatasi alcalina-CSPD, ha trovato applicazione in diagnostica clinica nel campo dei saggi immunologici e in biologia molecolare nei saggi di ibridazione del DNA fornendo fra le più elevate prestazioni di sensibilità ottenibili con questi sistemi [Pinzani et al., 1993; Schaap e Sandison, 1987; Girotti et al., 1991; Musiani et al., 1991]. Inoltre il tipo di cinetica relativamente costante dell’emissione luminosa, unitamente all’elevata efficienza quantica, consente l’uso di strumenti relativamente semplici, incluso sistemi fotografici, per la rilevazione del segnale analitico

Luminolo e derivati

Il luminolo ed i suoi derivati sono fra i composti chemiluminescenti che hanno trovato maggior utilizzazione in campo analitico [Pinzani et al.,1993; Roda et al., 1983].

La struttura base della molecola del luminolo (5 amino, 2-3 diidroftalazina, 1-4 dione) è costituita da due anelli adiacenti: uno aromatico, che non subisce nessuna variazione durante la reazione chemiluminescente, e l’altro eterociclico non aromatico che invece viene ossidato durante tale reazione dando origine allo ione ftalato in uno stato di eccitazione elettronica (tripletto) che ritornando allo stato fondamentale (singoletto), restituisce l’energia di eccitazione sotto forma di fotoni (Fig. 8).

La molecola di luminolo è stata a lungo studiata come base per la sintesi di derivati da utilizzare come marcatori in dosaggi immunologici non isotopici. In realtà la molecola del luminolo non può essere utilizzata per questo scopo, ma può essere solo modificata in modo da poter essere coniugata, con un legame chimico covalente e senza perdere in efficienza luminosa [Pazzagli, 1996].

Fig 8. Reazione di ossidazione del luminolo

Nella maggior parte dei casi si utilizzano i derivati (Fig. 9) della molecola base dell’isoluminolo (6 ammino, 2-3 diidroftalazina, 1-4 dione) invece che del luminolo, in quanto quest’ultimo, pur avendo un’efficienza luminosa inferiore può essere funzionalizzato sull’azoto dell’anello benzenico a differenza del luminolo mantenendo e a volte aumentando la propria efficienza luminosa [Pinzani et al., 1993].

 

Fig. 9. Struttura chimica dell'isoluminolo e di alcuni suoi derivati. (Pinzani, 1996)

Anche per il luminolo e i derivati dell’isoluminolo, sono stati messe a punto sistemi di accoppiamento con un enzima. In particolare si è sfruttato l’accoppiamento perossidasi+luminolo. Sebbene l’esatto meccanismo e la precisa natura delle specie emittenti non sia ancora completamente elucidata, uno schema di reazione comunemente accettato prevede l’ossidazione del luminolo mediante formazione di un complesso tra ossidante (H2O2) e perossidasi per produrre un radicale del luminolo. I radicali del luminolo intervengono poi in ulteriori reazioni che danno origine ad un endoperossido che successivamente si decompone in un dianione 3-aminoftalato in uno stato elettronicamente eccitato che emette luce nel suo ritorno allo stato fondamentale (Fig. 8) [Thorpe e Kricka, 1986].

La natura multistadio della reazione, con numerosi fattori limitanti e molte reazioni laterali che competono con la principale, determina un’efficienza quantica complessiva molto bassa e quindi non utilizzabile per scopi analitici. Per aumentare l’efficienza luminosa di questa reazione, sono state introdotte molecole quali i derivati del 6-benzotiazolo o fenoli sostituiti (denominati comunemente, amplificatori "enhancer") che si sono dimostrati molto efficienti nel miglioramento dell’emissione luminosa di questa reazione, fino a raggiungere in condizioni ottimali livelli anche 1000 volte superiori rispetto alla reazione chemiluminescente tradizionale ed inoltre, in particolari condizioni di reazione, l’emissione luminosa è prolungata e decade molto lentamente. L’entità del potenziamento della luce emessa dipende, oltre che dalla natura chimica della molecola enhancer, dalla sua concentrazione e dal momento in cui viene aggiunta alla reazione chemiluminescente, inoltre il potenziamento dell’emissione nel sistema luminolo-perossidasi è fortemente dipendente dal pH [Pazzagli, 1996]. L’emissione luminosa mostra un massimo di emissione a 425 nm, analogamente a quanto accade per la reazione non potenziata.

Il meccanismo mediante il quale gli enhancer agiscono nell’amplificazione della reazione luminolo-perossidasi non è completamente conosciuto. Molto probabilmente l’enhancer accelera, direttamente o indirettamente, una o più fasi della complessa serie di reazioni catalizzate dall’enzima prima dell’emissione luminosa (Fig. 10).

Fig. 10. Due modi d'uso del luminolo come composto chemiluminescente per metodi immunologici: chemiluminescenza convenzionale (A) e chemiluminescenza potenziata (B). (Pazzagli, 1996)

Applicazioni della chemiluminescenza in biologia e in medicina.

La relativa semplicità strumentale ma soprattutto l’elevata sensibilità analitica e l’ampia disponibilità di reazioni chemiluminescenti dotate di elevata specificità, ha portato ad un notevole aumento delle applicazioni di questa tecnologia in numerosi campi, tra i quali il campo biomedico, alimentare, ecc ( [Pazzagli, 1996; Campbell, 1988; Stanley e Kricka, 1990; Girotti et al., 1997; Roda et al., 1983].

Bibliografia

 

Scheda dalla tesi di Annalisa Sandrini: "Amplificazione in vitro di sequenze genomiche di Erwinia amylovora e rivelazione chemiluminescente dopo ibridizzazione del DNA in soluzione (PCR-ELISA)"