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strettamente legato alla concentrazione di analita nel campio-
ne, permettendo così lo sviluppo di metodi quantitativi precisi
ed ultrasensibili caratterizzati da ampi ambiti di linearità, che
possono raggiungere anche 5 decadi di concentrazione. I si-
stemi chemiluminescenti più interessanti sono quelli caratte-
rizzati da una cinetica dell'emissione di tipo "steady-state",
cioè con un segnale analitico che raggiunge rapidamente il
valore ottimale e si mantiene stabile per alcuni minuti, il che
semplifica la strumentazione richiesta ed in genere tutte le fa-
si del processo analitico.
Misura di substrati ed attività enzimatiche
L'accoppiamento di reazioni enzimatiche che utilizzano ATP o
NAD(P)/NAD(P)H come cofattore (quali quelle catalizzate da-
gli enzimi chinasi o deidrogenasi) con sistemi bioluminescenti,
come la reazione luciferina/ATP/luciferasi o quella della lucife-
rasi batterica NAD(P)/NAD
(P)H-dipendente [1], ha
permesso di sviluppare
metodi ultrasensibili per la
determinazione di molti
substrati, quali alcool, lat-
tosio, acidi biliari. Anche il
sistema chemiluminescen-
te luminolo/H
2
O
2
/perossi-
dasi è stato accoppiato a
molte ossidasi che coinvol-
gono H
2
O
2
, quali la gluco-
sio ossidasi, la colesterolo
ossidasi o la colina ossida-
si, per l'analisi di glucosio,
colesterolo e fosfolipidi. I
metodi bio-chemilumine-
scenti permettono anche di
misurare direttamente l'at-
tività di enzimi, e possono
quindi essere impiegati per la valutazione dell'efficacia di inibi-
tori enzimatici. Ad esempio, il luminolo può agire come cosub-
strato riducente dell'enzima ciclossigenasi offrendo (COX) un
modo semplice e veloce per determinare l'attività delle due
isoforme (COX-1 e COX-2) di questo enzima mediante misu-
re di chemiluminescenza [6]. Questo metodo è stato utilizza-
to per effettuare lo screening di potenziali inibitori enzimatici
allo scopo di valutare la loro selettività nei confronti dell'iso-
forma COX-2, la più importante dal punto di vista farmacolo-
gico (Figura 4). Esiste poi una vastissima letteratura scientifi-
ca su sistemi a flusso tipo Fia (Flow injection analysis) con ri-
velazione chemiluminescente per la determinazione rapida,
sensibile ed automatizzata di analiti in molti fluidi biologici e
in matrici agro-alimentari. La selettività di questi sistemi di
analisi è spesso determinata dall'uso di reazioni enzimatiche
(semplici o accoppiate) in grado di produrre chemilumine-
scenza in presenza dell'analita, catalizzate da enzimi immo-
bilizzati in opportuni reattori a flusso.
"Imaging" in bio- e chemiluminescenza
Le tecniche di "imaging" (cioè basate sulla determinazione
della distribuzione spaziale del segnale) rappresentano un
altro importante settore di applicazione della bio-chemilumi-
nescenza, ed in letteratura è riportata una vasta gamma di
applicazioni, sia su campioni macroscopici sia microscopici,
in campo biomedico e diagnostico e per lo sviluppo di nuovi
farmaci [5, 7-9]. L'utilizzo di sistemi chemiluminescenti basati
su reazioni enzimatiche semplici od accoppiate permette di
valutare la localizzazione di analiti e enzimi in tessuti e cellu-
le in modo estremamente più sensibile rispetto all'utilizzo di
substrati cromogenici o fluorescenti. I sistemi di rivelazione
chemiluminescenti sono stati anche utilizzati in tecniche di
immunoistochimica (Ihc) e di ibridazione in situ (Ish) per la
localizzazione di antigeni specifici e acidi nucleici in singole
cellule e in tessuti. Tali tecniche presentano una sensibilità
maggiore rispetto ai metodi di rivelazione convenzionali (ba-
sati principalmente su colorimetria e fluorescenza) e presen-
tano il vantaggio di fornire informazioni quantitative sulla di-
stribuzione spaziale di patogeni, antigeni ecc. Anche le già
menzionate tecniche di fluorescenza risolta nel tempo sono
state applicate in questo
settore (Figura 5). Le
tecniche di "imaging" in
chemiluminescenza per-
mettono anche lo studio
dei processi fisiopatolo-
gici sia determinano
emissione di luce. La
chemiluminescenza è
stata ampiamente utiliz-
zata per analizzare la
formazione di specie
reattive dell'ossigeno
(Ros) sia in colture cel-
lulari che in organi isola-
ti. Ad esempio, median-
te misure di "imaging" in
chemiluminescenza è
stato possibile valutare
in modo quantitativo la
formazione di Ros in fegati di ratto isolati e perfusi sottoposti
ad ischemia e riperfusione [10]. Un modello di questo tipo
potrebbe permettere di effettuare studi sulla fisiopatogenesi
dei processi di stress ossidativo, ma anche di studiare com-
posti ad attività antiossidante e valutare l'efficacia delle pro-
cedure di conservazione degli organi per trapianti.
Un'altra recente applicazione delle tecniche di "imaging" in
chemiluminescenza consiste nella visualizzazione in tempo
reale del processo di frazionamento degli analiti in tecniche di
frazionamento in campo-flusso (Field-flow fractionation, Fff).
Le tecniche Fff sono una famiglia di tecniche separative, affini
alle tecniche cromatografiche, nelle quali il frazionamento de-
gli analiti è determinato, piuttosto che dall'interazione degli
analiti con una fase stazionaria, dall'azione di un campo
esterno di varia natura (gravitazionale, elettrico, termico...)
perpendicolare al flusso della fase mobile. Queste tecniche
possono essere utilizzate per la caratterizzazione, sulla base
di proprietà quali dimensioni, densità o caratteristiche superfi-
ciali, di analiti di varia natura, da piccole molecole a cellule
[11]. Una camera Ccd ultrasensibile è stata utilizzata per vi-
sualizzare il segnale CL proveniente dall'elemento di frazio-
namento del sistema Fff durante la separazione di campioni
costituiti da sfere di polistirene rivestite con l'enzima perossi-
dasi. L'aggiunta dei substrati chemiluminescenti dell'enzima
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Figura 5 - Localizzazione immunoistochimica di un antigene (Psa)
in sezioni di prostata mediante una tecnica di "imaging" in fluorescenza
risolta nel tempo. L'antigene è stato localizzato utilizzando un anticorpo
primario biotinilato anti-Psa ed un sistema di rivelazione amplificato
che sfrutta la reazione biotina-streptavidina, basato su di un polimero
marcato con un chelato di europio. Da sinistra a destra sono
mostrate l'immagine in luce trasmessa, il segnale di fluorescenza
risolta nel tempo e la loro sovrapposizione dopo conversione
in pseudocolori del segnale di fluorescenza