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funzioni biologiche simultaneamente. La principale limitazione
per lo sviluppo di metodi fotoluminescenti ultrasensibili è lega-
ta al fatto che la fotoeccitazione non è selettiva: molte altre
molecole presenti nel campione o nella matrice biologica ven-
gono anch'esse eccitate, dando luogo a processi di autofluo-
rescenza, con conseguente drastica riduzione del segnale
analitico "pulito". Sono stati effettuati numerosi tentativi per
aumentare la selettività del segnale fluorescente, sviluppando
per esempio traccianti con un elevato assorbimento molare e
caratterizzati da un elevato spostamento di Stokes, in modo
da ottenere un'emissione nel rosso, una zona spettrale dove
poche molecole organiche naturali emettono. Tra queste, le
più studiate sono le porfirine e le ficobiliproteine: per esempio
la ficoeritrina presenta un coefficiente di estinzione molare di
2x10
6
M
-1
cm
-1
. Tuttavia, la parziale sovrapposizione delle
bande degli spettri di eccitazione ed emissione non permette
di ottenere la selettività necessaria per abbassare i limiti di ri-
velazione a valori inferiori
a 10
-15
moli, necessari per
la determinazione di mo-
lecole di interesse dia-
gnostico o presenti in
tracce, quali farmaci e in-
quinanti ambientali.
Le migliori prestazioni
analitiche in termini di ri-
velabilità dei metodi foto-
luminescenti sono state
però ottenute sfruttando
una originale e interes-
sante proprietà fotofisica
di alcuni complessi di
metalli di transizione, in
particolare i lantanidi. La
sorprendente peculiarità
di questi complessi consi-
ste nella capacità di as-
sorbire flash di luce ultra-
violetta di breve durata
(ad esempio ~10
-6
sec) e
di riemettere la radiazio-
ne assorbita ad una lun-
ghezza d'onda nel visibile
in un tempo molto più
lungo (~10
-6
-10
-3
sec) ri-
spetto a quello caratteri-
stico della fluorescenza delle comuni molecole organiche
(~10
-9
sec). La misura dell'emissione con un ritardo rispetto
all'eccitazione permette quindi di rilevare soltanto la fluore-
scenza derivante dal complesso dello ione lantanide, con
conseguente aumento di selettività rispetto ad una misura in
fotoeccitazione costante. Tale tecnica di misura della fluore-
scenza, definita di fluorescenza risolta nel tempo, ha avuto e
continua ad avere notevoli applicazioni nell'ambito della
bioanalitica: l'uso di chelati di ioni lantanidi come traccianti
per metodi biospecifici di tipo immunologico o genico ha per-
messo di raggiungere limiti di rivelazione dell'ordine di 10
-15
-
10
-18
moli, eguagliando o superando le prestazioni dei meto-
di basati sull'uso di radiotraccianti.
Va ricordata inoltre un'interessante applicazione della fluore-
scenza riguardante lo sviluppo di metodi immunologici basati
su misure di fluorescenza polarizzata. È noto che una luce
polarizzata eccita solo le molecole che hanno i dipoli paralleli
al piano di polarizzazione della luce eccitatrice. La radiazione
di fluorescenza emessa dalla molecola eccitata è polarizzata
nella stessa direzione, ma se nel tempo intercorso fra l'assor-
bimento e l'emissione di radiazione la molecola ha ruotato su
se stessa la polarizzazione della radiazione emessa non coin-
ciderà più con quella della radiazione di eccitazione. Il grado
di polarizzazione della radiazione emessa dipenderà quindi
dal tempo di emivita dello stato eccitato e dal movimento rota-
torio della molecola. Una molecola di grosse dimensioni (ad
esempio un anticorpo o un recettore) ha un tempo di rotazio-
ne di ~10-100 ns, mentre una molecola di piccole dimensioni
ruota su se stessa in ~0,1-1 ns. Una piccola molecola marca-
ta con un fluoroforo (ad esempio fluorescina) non sarà quindi
in grado di mantenere la polarizzazione della luce emessa; se
invece essa è legata ad un anticorpo il suo movimento viene
rallentato e la fluorescenza sarà parzialmente polarizzata.
Mediante tale principio è
stato possibile mettere a
punto una vasta serie di
metodi immunologici
omogenei per la determi-
nazione di farmaci, or-
moni steroidei e droghe
d'abuso. Grazie alla loro
semplicità, rapidità e fa-
cilità di automazione, i
metodi omogenei basati
su misure di fluorescen-
za polarizzata hanno
avuto un'ampia diffusio-
ne e sono attualmente
tra i più utilizzati a livello
mondiale nei laboratori di
chimica clinica. Le tecni-
che basate su misure di
bio-chemiluminescenza
offrono potenzialmente
un mezzo per ottenere
una migliore rivelabilità
rispetto alle tecniche ba-
sate sulla fotolumine-
scenza. Esse presenta-
no infatti un più elevato
rapporto segnale/rumore
in quanto l'emissione di
fotoni deriva da un processo "buio" e l'unico tipo di rumore
presente è quello strumentale. Al contrario, le tecniche fotolu-
minescenti risentono dell'emissione aspecifica da parte del
campione e dello scattering della radiazione di eccitazione, e
presentano inoltre problemi strumentali legati a fenomeni di
"drift" della sorgente e del rivelatore. Un altro importante van-
taggio della bio-chemiluminescenza è che l'emissione di foto-
ni deriva da un processo chimico altamente specifico che av-
viene a carico dell'analita ed è quindi meno influenzata dai
costituenti della matrice. L'emissione è comunque meno in-
tensa rispetto a quella derivante da fenomeni di fotolumine-
scenza, la cui intensità è ovviamente funzione della potenza
della sorgente di eccitazione. Il segnale bio-chemilumine-
scente può comunque essere amplificato chimicamente sfrut-
tando reazioni consecutive e cicliche. In appropriate condizio-
ni sperimentali il segnale analitico, cioè l'emissione di fotoni, è
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Figura 4 - Determinazione dell'attività di inibitori della ciclossigenasi
mediante chemiluminescenza. Da sinistra a destra e dall'alto in basso:
principio del metodo che permette di misurare l'attività dell'enzima
mediante chemiluminescenza; immagine in pseudocolori del segnale
chemiluminescente ottenuto in una piastra microtiter a 384 pozzetti;
profili cinetici del segnale chemiluminescente ottenuti in presenza di
concentrazioni crescenti di inibitore; curva di inibizione, derivata
dall'analisi dei profili cinetici, che mostra l'efficacia dell'inibitore in esame