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za in modo da ottenere preferenzialmente un prodotto in uno
stato elettronicamente eccitato; inoltre, il sito attivo dell'enzi-
ma determina un microambiente in grado di favorire il decadi-
mento radiativo dello stato eccitato. Come risultato del con-
trollo operato dall'enzima sul decorso della reazione, le rese
quantiche di emissione delle reazioni bioluminescenti sono in
genere molto più alte di quelle delle reazioni chemilumine-
scenti, raggiungendo talvolta valori vicini all'unità.
La bioluminescenza può presentarsi in un ampio intervallo di
colori, che spesso sono determinati dalle caratteristiche
dell'ambiente: negli organismi marini la bioluminescenza è
prevalentemente di colore blu, poiché le radiazioni di questa
lunghezza d'onda si propagano a maggiori distanze nell'ac-
qua. Gli organismi viventi ricorrono a metodi ingegnosi per
modificare la lunghezza d'onda della radiazione emessa, ed
alcuni sono in grado di emettere contemporaneamente biolu-
minescenza di due differenti colori. Ad esempio, il verme Ph-
rixothrix hirtus
possiede orga-
ni luminosi distinti caratteriz-
zati da bioluminescenze di
colore rosso e verde. Il colore
della bioluminescenza è
spesso determinato dalla
struttura delle luciferasi coin-
volte nel processo: piccole
variazioni strutturali di tali
proteine sono in grado di de-
terminare differenze significa-
tive nella lunghezza d'onda di
emissione. In altri casi il colo-
re della bioluminescenza vie-
ne modificato attraverso l'uso
di proteine fluorescenti ac-
cessorie, che permettono di
aumentare la lunghezza d'on-
da della bioluminescenza a
seguito di un processo di tra-
sferimento di energia, o me-
diante l'uso di filtri interni che
assorbono selettivamente al-
cune lunghezze d'onda [3].
La luminescenza
in chimica analitica
Dal punto di vista chimico-
analitico la luminescenza
rappresenta uno strumento fondamentale e molto versatile
per lo sviluppo di metodologie analitiche sensibili e specifi-
che, con ampie applicazioni in biomedicina, biotecnologia,
biologia molecolare, farmacologia e in chimica ambientale e
agroalimentare [4, 5]. I sistemi basati su principi di chemilu-
minescenza (Figura 2) hanno, ad esempio, quasi completa-
mente rimpiazzato i radioisotopi, quali
3
H e
125
I, largamente
utilizzati per oltre trent'anni in chimica clinica per la marcatu-
ra e preparazione di traccianti.
Storicamente la fotoluminescenza, ed in particolare la fluore-
scenza, ha rappresentato il primo esempio di metodologia
analitica con elevata rivelabilità. Molti fluorofori sono stati svi-
luppati ed applicati in svariati settori della chimica analitica;
basti ricordare il vasto utilizzo della fluorescina e di suoi ana-
loghi in campo immunoistochimico e come traccianti ed il suo
ruolo trainante per la ricerca di traccianti sempre più efficienti
e selettivi. Sono ormai disponibili nella routine bioanalitica si-
stemi "microarray" su chip per screening ad elevata produtti-
vità analitica in biologia molecolare e genetica. L'accoppia-
mento della specificità della reazione di ibridazione degli acidi
nucleici con l'uso di "probe" fluorescenti con emissione a di-
verse lunghezze d'onda, e quindi con diversi colori, ha per-
messo di sviluppare "microarray" di piccole dimensioni basati
su una serie di sonde geniche immobilizzate e su "imaging"
del segnale fluorescente mediante videocamere Ccd (Char-
ge-coupled device) ad alta sensibilità. Un altro, e forse più an-
cora importante, avanzamento tecnologico della fluorescen-
za, è stato la scoperta e la definizione del meccanismo della
fluorescenza di proteine, ed in particolare della "Green fluore-
scent protein" (Gfp) estratta dalla medusa Aequorea victoria
(Figura 3). Oggi si conosce tutto sulla Gfp, dalla sua sequen-
za amminoacidica alla struttura del sito attivo, e questa protei-
na è stata clonata ed utilizzata in moltissimi settori della bio-
chimica. È ad esempio possibile mediante tecniche di inge-
gneria genetica ottenere proteine di fusione contenenti la Gfp
e specifiche proteine organo- o organello-specifiche, accop-
piando il gene della Gfp ai geni che codificano per le proteine
di interesse. La capacità di queste proteine di localizzarsi
all'interno di determinati organi od organelli permette di ren-
dere fluorescenti specifici elementi sub-cellulari e di sviluppa-
re affascinanti tecniche istochimiche fluorescenti per lo studio
dell'architettura cellulare. La conoscenza della struttura della
Gfp ha poi permesso di ottenere forme mutanti della proteina
che emettono luce ad altre lunghezze d'onda (giallo, rosso)
permettendo lo sviluppo di metodi per lo studio di più analiti o
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Figura 2 - Rappresentazione schematica di alcune delle più comuni
reazioni bio- e chemiluminescenti utilizzate in chimica analitica.
Dall'alto in basso: le reazioni responsabili della bioluminescenza
delle lucciole e di alcuni batteri marini, l'ossidazione del luminolo
catalizzata dall'enzima perossidasi, la reazione di decomposizione
di un substrato chemiluminescente (1,2-diossietano arilfosfato)
catalizzata dall'enzima fosfatasi alcalina
Figura 3 - La medusa
Aequorea victoria è
probabilmente il più famoso
organismo marino
bioluminescente. Lo studio
di questa medusa ha condotto
alla scoperta della Gfp
e della fotoproteina equorina.
Riprodotto su autorizzazione
dal riferimento bibliografico [2]